Вопросы для самоконтроля

1. В чем выражается рост микроорганизмов?

2. Как происходит размножение микроорганизмов?

3. Охарактеризуйте основные фазы цикла развития культуры бактерий.

4. Дайте характеристику процессу непрерывного культивирования микроорганизмов.

5. Что такое синхронные культуры бактерий?

9. Подготовка биологических объектов для биотехнологического процесса

Выделение и подбор объекта – является важным этапом биотехнологического процесса. Однако путем простого подбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции.

Селекция– это направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Основной путь селекции – это путь от слепого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов.

Традиционно для повышения продуктивности штаммов микроорганизмов использовали мутагенезс последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. Таким способом за длительное время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий и др. В процессе отбора на каждом этапе из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Однако использование метода селекции, основанного на спонтанных мутациях, ограничено их низкой частотой, что затрудняет интенсификацию процесса. Изменения в структуре ДНК происходят редко (10^-10на каждый ген). Несмотря на это, в очень больших популяциях (10¹⁵…..10¹⁷клеток) даже в одной генерации появляется 10⁵…10⁷мутантных клеток по каждому гену. Спонтанные мутации помогают микробным популяциям приспосабливаться к новым условиям существования. Примером отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме является отбор дрожжей Saccharomyces uvarum по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей. Происходит образование обратной связи между параметром, характеризующим жизнедеятельность культуры (выделением ею СО₂) и поступлением ингибирующего фактора – этанола в биореактор. При продолжительном культивировании в такой установке получают мутантные дрожжи, устойчивые к ингибирующему действию этанола в концентрациях до 10 %. Такой подход используют для повышения устойчивости биообъектов к различным факторам: кислотам, щелочам, продуктам метаболизма, ионам тяжелых металлов и др.

Селекционеры микроорганизмов, как правило, используют индуцированный мутагенез, который способствует резкому увеличению частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или γ-излучение, корпускульные излучения типа быстрых электронов, позитронов, протонов, нейтронов, а также некоторые химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК. К числу наиболее зарекомендовавших себя мутагенов относятся азотистая кислота, алкилирующие агенты, акридиновые красители, бромурацил и др. К биологическим мутагенам относятся фаги.

Впервые в истории микробиологии и генетики возможность экспериментального получения мутаций у микроорганизмов была установлена советскими учеными Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым в 1925 г. С помощью рентгеновских лучей они нашли наследственно стойкие варианты Mucor genevensis. Широкое использование УФ- и рентгеновских лучей началось после Второй мировой войны в селекции активных продуцентов антибиотиков.

Мутационные изменения затрагивают целый ряд генов и приводят как к физиологическим, так и к морфологическим изменениям мутанта, в результате которых могут меняться требования мутанта к питательной среде и к условиям культивирования.

Последовательное воздействие одного или нескольких мутагенных факторов при ступенчатом отборе позволяет постепенно увеличить продуктивность штамма. Например, путем многократного воздействия мутагенами и отбора удалось синтетическую способность продуцента пенициллина гриба Penicillium chrysogenum в течение 40 лет увеличить в 12 тыс. раз.

Недостатками метода индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора являются:

- трудоемкость;

- отсутствие сведений о характере мутаций, т.к. селекционер проводит отбор по конечному результату.

Достижения молекулярной генетики позволили ввести в практику целенаправленные методы отбора продуцентов – по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта.Любое генетическое изменение в первую очередь затрагивает деятельность ферментов клетки. Данный метод основан на регуляции ферментов по принципу обратной связи конечным продуктом биосинтетического пути (рис. 43). Повышение концентрации метаболита ингибирует активность фермента, участвующего в синтезе метаболита, или репрессирует синтез этого фермента.

Рис. 43. Негативная регуляция биосинтетического пути конечным продуктом:

A, B, C, D – продукты реакций, катализируемые ферментами Ea, Eb, Ec, Ed

Например, при наличии глюкозы и NH₄⁺ клетки многих бактерий синтезируют все необходимые для жизнедеятельности азотсодержащие соединения. Если в среду добавить какую-либо аминокислоту, то ее синтез прекращается. Такой же эффект вызывают структурные аналоги метаболита, которые не могут функционально заменить метаболит. Так аналог аминокислоты не может войти в состав белка, поэтому в присутствии аналога рост нормальных клеток подавляется в связи с голоданием по целевому продукту. В таких условиях выживают лишь мутантные клетки с нарушенной регуляцией активности и синтеза ферментов. Мутации типов:

- фермент Еа сохранил функциональную активность, но потерял чувствительность к ингибирующему действию конечного продукта или его аналога;

- синтез фермента Еа устойчив к избытку продукта или его аналога

ведет к появлению сверхпродуктов, синтезирующих целевой метаболит в аномально высоких концентрациях.

В тех случаях, когда необходимо добиться накопления промежуточного продукта биосинтетического пути используют мутанты, у которых блокирован следующий за интермедиатом этап синтеза (рис.44).

Рис.44. Блокирование промежуточной реакции биосинтетического пути с целью получения сверхпродуцента

Такой мутант ауксотрофен, т.е. растет только при добавлении в среду культивирования вещества, служащего продуктом блокированной реакции. Однако возможны компенсирующие мутации, ведущие к активации альтернативных путей синтеза недостающих соединений. Таким образом, этот путь селекции основан на переходе от прототрофных к ауксотрофным по определенному соединению штаммам.

Следует отметить, что приоритет селекции в получении «сверхсинтетиков» в настоящее время утрачен в связи с развитием основ и практическим использованием методов генной инженерии в получении продуцентов с заданными свойствами на основе рекомбинации ДНК.