2. Введение гена в вектор.
Ген, полученный одним из выше описанных способов, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Для этого нужны дополнительные механизмы, управляющие действием, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов.
Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Полученная линейная молекула ДНК должна содержать липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы (рис. 45).
Рис.45. Встраивание изолированного гена в генетический вектор
Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. При использовании в качестве генетических векторов вирусов возникает проблема – ослабление их патогенности для хозяина. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов дает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма, что является перспективным при лечении наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем ~ 1011клеткам человеческого тела.
Однако наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды E. coli. Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т.е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т.е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипического выражения генов.
При конструировании векторов в них вводят участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам отбирают клетки, являющиеся носителями вектора.
В генетической инженерии растений чаще всего используют бактерии родов RhizobiumиAgrobacterium.
3. Перенос генов в клетки организма-реципиента.
Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, то наиболее распространенным способом передачи информации является трансформация.
Чтобы клетку легко можно было трансформировать она должна быть компетентной. Компетентность бактериальных клеток достигают обработкой СаСl2, полиэтиленгликолем, воздействием теплового удара. ДНК легко проникают в клетку через цитоплазматическую мембрану протопластов. Протопласты бактерий получают при обработке лизоцимом, который гидролизирует мукопептиды клеточной стенки. Протопласты клеток растений и дрожжей получают, разрушая ферментами полисахариды оболочки. Эффективность трансформации протопластов эукариот увеличивает диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль. ДНК в клетки высших организмов вводят микроинъекцией.
Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Однако существуют еще два способа передачи генетической информации – конъюгация и трансфекция, которые можно рассматривать как варианты трансформации.
При конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). Неконъюгативные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид-помощников.
Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию вирусных частиц в клетке. Трансфекция бактерий включает следующие этапы: получение сферопластов, очистка среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК фага (с добавлением протаминсульфата, повышающим эффективность трансфекции). Трансфекцию клеток растений и животных осуществляют двумя способами: использованием очищенной ДНК и протопластов, а так же заражением целых многоклеточных организмов (в этом случае говорят об инфекции) вирусными частицами или ДНК. Кроме того, сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.