Тема 11. Використання трансгенних тварин у фундаментальних дослідженнях Форма опрацювання навчального матеріалу : підготовка і презентація міні-лекції

Під час вивчення цієї теми студент має засвоїти знання про:

Феномен трансгенозу. Необхідність одержання трансгенних тварин.

Вектори, що використовуються для доставки трансгенів в організм ссавців. Шляхи отримання трансгенних тварин.

Методи перенесення in vitro екзогенної ДНК в тваринні клітини.

Фактори, що впливають на експресію трансгенів в організмі трансгенних тварин. Спрямована активація та інактивація генів in vivo. Класичний підхід до одержання генних нокаутів.

Сучасні методи інактивації генів з використаннямм енхансерних, генних та промоторних ловушок.

Мікроін'єкції ДНК в пронуклеус запліднених яйцеклітин. Інтеграція трансгенів в хромосоми тварин. Експресія трансгенів в тваринних клітинах.

Методи, проблеми та перспективи клонування хребетних тварин.

Трансгенні тварини- біореактори («біологічні фабрики»). Трансгенні тварини з виключеними генами (генний нокаут).

Трансгенні тварини як генетичні моделі спадкових захворювань.

Тема 12. Перспективні шляхи використання методів генотерапії Форма опрацювання навчального матеріалу : презентація експертної оцінки

Під час вивчення цієї теми студент має засвоїти знання про:

Поняття про генну терапію. Типи генотерапії.

Розробка програми генної терапії, її етапи. Стратегії генної терапії.

Шляхи ex vivo та in vivo перенесення генетичної інформації в організм хворих. Приклади лікування хвороб шляхом генотерапії ex vivo та in vivo.

Вектори для генної терапії (вірусні, невірусні). Маркери в генній терапії.

Підходи до генної терапії раку. Генна терапія інфекційних захворювань. Перспективні шляхи використання методів генотерапії.

Етичні проблеми генної терапії. Проблеми генетичної безпеки людини. Законодавство з питань генетичної безпеки людини.

Сучасні проблеми та практичне використання досягнень генної інженерії.

Перспективи розвитку генної інженерії у XXI столітті.

Критеріями оцінювання є кількість опрацьованих статистичних матеріалів, якість аналізу, вміння сформулювати висновки та обґрунтувати їх.

Критерiї оцiнки самостйного опрацювання навчального матеріалу:

2.1. За шкалою ЕСТS – “А”, за шкалою навчального закладу 90 – 100 балiв, за нацiональною шкалою “відмінно” – студент дає вичерпнi, обгрунтованi, теоретично i практично вiрнi вiдповiдi не менш нiж на 90% запитань, демонструє знания пiдручникiв, посiбникiв, iнструкцiй, проводить узагальнення i висновки.

2.2. За шкалою ЕСТS – “ВС” за шкалою навчального закладу 75 – 89 балiв, за нацiональною шкалою “добре”– коли студент володiє знаннями матерiалу на рiвнi 2.1, але допускає незначнi помилки у формуваннi термiнiв, категорiй i розрахункiв, проте за допомогою викладача швидко орiєнтується i знаходить правильнi вiдповiдi.

2.3. За шкалою ЕСТS – “DЕ”, за шкалою навчального закладу 60 – 74 балiв, за нацiональною шкалою “задовільно”– коли студент дає правильну вiдповiдь не менше нiж на 60% питань, або на всi запитання дає недостатньо обгрунтованi, невичерпнi вiдповiдi, допускає грубi помилки, якi виправляє за допомогою викладача.

2.4. За шкалою ЕСТS – “FX”, за шкалою навчального закладу 35 – 59 балiв, за нацiональною шкалою “незадовiльно з можливiстю повторного складання” – студент на всi запитання дає необгрунтованi, невичерпнi вiдповiдi, допускає грубi помилки, якi частково виправляє за допомогою викладача.

2.5. За шкалою ЕСТS – “F”, за шкалою навчального закладу менше 35 балiв, за нацiональною шкалою “незадовiльно з обов’язковим повторним курсом” – коли студент дає правильну вiдповiдь менше нiж на 35% питань, або на всi запитання дає необгрунтованi, невичерпнi вiдповiдi, допускає губi помилки.

Оцінювання знань студентів за підсумкового контролю здійснюється на основі результатів поточного і підсумкового контролю знань. Загальна підсумкова оцінка з дисципліни складається із суми балів за результатами поточного контролю й за виконання завдань, що виносяться на іспит.

ІНДИВІДУАЛЬНІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ

(ДЛЯ ЗАОЧНОЇ ФОРМИ НАВЧАННЯ)

1. Основні етапи технології рекомбінантних ДНК

2. Виділення генів із ДНК за допомогою ферментів.

3. Характеристика рестрикційних ендонуклеаз

4. Номенклатура, класифікація рестрикційних ендонуклеаз

5. Механізм дії рестриктаз І і ІІ класів. Характеристика дії різних типів

рестриктаз ІІ класу

6. Принцип будови рестрикційних карт

7. Штучна рекомбінація генів

8. Одержання рекомбінантних ДНК за допомогою рестрикційних

екндонуклеаз.

9. Синтез генів на основі виділеної із клітини мРНК.

10. Методи виділення мРНК: ферменти, які використовуються в цьому

процесі.

11. Фосфороамідітний метод.

12. Синтез коротких і довгих генів.

13. Способи конструювання великого гену

14. Секвенування ДНК дидезоксинуклеотидним методом

15. Секвенування на основі фага μ13

16. Вектори в генетичній інженерії

17. Властивості векторів

18. Вектори-плазміди

19. Загальна характеристика плазмід

20. Явище хромосомної міграції генів стійкості до антибіотиків

21. Ветори на основі бактеріофага λ

22. Вектори-косміди

23. Ретровірусні вектори

24. Стадії життєвого циклу ретровірусів. Властивості ретровірусів

25. Вбудовування генів в вектор

26. Методи для вбудовування генів в вектор

27. Шляхи перенесення генетичного матеріалу: трансдукція, тансформація,

трансфекція і ін.

29. Підвищення компетентності прокаріотичних і еукаріотичних клітин

30. Механізм проникнення молекули ДНК в середину бактеріальної клітини

31. Клонування генів

32. Експресія генів, клонованих в прокаріотичних системах

33. Основні властивості систем експресії

34. Химерні білки

35. Особливості експресії еукаріотичних генів

36. Системи експресії у дріжджів

37. Одержання трансгенних тварин

38. Основні переваги і недоліки використання ретровірусів для одержання

трансгенних тварин.

Основи генної інженерії

Питання до змістового модулю 1

1. Предмет і задачі генетичної інженерії.

2. Головні напрямки та перспективи развитку сучасної науки. Історія виникнення та розвитку досліджень у галузі генетичної інженерії. Розвиток генетичної інженерії в Україні.

3. Генна інженерія як складова частина біотехнології. Об'єкти генної інженерії. Роль генної інженерії у розвитку біотехнології, сільського господарства, медицини, охорони природи.

4. Поняття про геном. Структурно-функціональна організація геномів вірусів, прокаріотів та еукаріотів. Особливості геному людини

5. Сучасне визначення поняття про ген. Транскрипція. Регуляторні елементи генів. Генетичний код. Схема реалізації генетичної інформації в організмі.

6. Генетичні та фізичні карти геному.

7. Мінливість геному. Поліморфні сайти рестрикції. ПДРФ-аналіз та його використання.

8. Варіабельні мікро- та мінісателітні ДНК. ДНК-фінгерпринт. Геномна дактилоскопія та її використання.

9. ПДРФ-аналіз та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) як методи аналізу геномної ДНК.

10. Ферменти, що використовуються в генній інженерії, їх характеристика.

11. Властивості нуклеаз та способи їх використання в генній інженерії.

Явище модифікації-рестрикції. Ферменти рестрикції і модифікації.

12. Системи модифікації-рестрикції класу І. Ендонуклеази рестрикції класу І та ІІІ. Ендонуклеази рестрикції класу ІІ. Характеристика сайтів впізнавання цих ферментів. Ізошизомери. Розщеплення молекул ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції класу ІІ. Умови розщеплення.

13. Основні способи використання ендонуклеаз рестрикції класу ІІ в генетичній інженерії. Принципи фізичного картування геномів. Методи побудови рестрикційних карт.

14. Отримання та аналіз макрофрагментів ДНК. Поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів та його використання.

15. ДНК-лігази. Механізм лігірування ДНК Т4-ДНК-лігазою.

16. Властивості ДНК-полімераз та способи їх використання в генній інженерії. Типи нуклеазної активності. Будова та властивості ДНК-полімерази І та її Кленов-фрагмента, Умови синтезу ланцюгів ДНК іn vitro за допомогою ДНК-полімераз.

17. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Будова сучасного ампліфікатора. Компоненти реакційної суміші, необхідні для проведення ПЛР. Властивості Taq-ДНК-полімерази. Фактори, що впливають на точність синтезу ДНК та можливості її підвищення. Специфічність та ефективність ПЛР. Стандартні умови та критичні параметри проведення ПЛР. Цикли ПЛР. Джерела ДНК для ПЛР.

18. Варіанти ПЛР (RT-ПЛР, ПЛР-in situ, асиметрична ПЛР) та їхні можливості. Ампліфікація довгих фрагментів ДНК. Методи підвищення точності ампліфікації. Практичне використання ПЛР .

19. Будова, властивості РНК-залежних ДНК-полімераз (зворотніх транскриптаз) ретровірусів, їх використання для одержання кДНК.

20. Характеристика ферментів, що використовуються при конструюванні рекомбінантних ДНК: ферменти, за допомогою яких одержують фрагменти ДНК; ферменти, що синтезують ДНК на матриці ДНК або РНК; ферменти, що з’єднують фрагменти ДНК; ферменти, які дозволяють здійснити зміну структури кінців фрагментів ДНК.

21. Етапи виділення ДНК.Особливості виділення плазмідної та вірусної ДНК.

22. Синтез ДНК та рестрикція. ДНК- рестриктази. Класи рестриктаз: часто- (4-5 п.о.), середньо-(6-8 п.о.) та рідкорозщеплюючі (8-12 п.о.). Використання сайтів рестрикції в якості генетичних маркерів ДНК. Фізичне картування ДНК. Поняття про шмер.

23. Синтез генів in vitro.Хімічний синтез олігодезоксирибонуклеотидів.

24. Методи хімічного синтезу олігонуклеотидів: фосфатдиефірний, фосфаттриефірний, фосфіттриефірний. Принцип блочного синтезу.

25. Етапи синтезу дволанцюгових фрагментів ДНК in vitro. Властивості ДНК-лігаз. Синтез Х.Кораною генів т-РНК. Синтез К.Ітакурою генів інсуліну, соматотропину. Хімічний синтез лінкерів, адаптерів, регуляторних ділянок, ДНК-зондів, праймерів, нонсенс-кодонів.

26. Ферментативний синтез генів. Властивості та особливості використання полінуклеотидфосфорилаз. Синтез к-ДНК за участю зворотної транскриптази (ревертази).

27. Комбінування хімічного та ферментативного синтезу полінуклеотидів. Монтування генів.

28. Гібридизація нуклеїнових кислот in situ. Блот-гібридизація нуклеїнових кислот. Поняття про блоттинг. Фіксація нуклеїнових кислот на фільтрах. Методи гібридизації нуклеїнових кислот: гібридизація за Саузерном, Нозерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, дот- та слот- гібридизація (етапи проведення та розрішальна здатність).

29. Напрямки використання методів гібридизації нуклеїнових кислот (ідентифікація генів та вивчення їх експресії, діагностика спадкових захворювань та інфекційних агентів, визначення спадкового поліморфізму, проведення таксономічних досліджень та геномної дактилоскопії тощо).

Створення і використання ДНК-мікрочіпів.

Основні недоліки метода блот-гібридизації.

30. Секвенування молекул нуклеїнових кислот. Методи визначення нуклеотидної послідовності РНК. Метод секвенування ДНК за допомогою специфічного хімічного розщеплення ( метод Максама і Гілберта). Отримання субстратів для цього методу. Характеристика реакцій, які використовуються для специфічної фрагментації ДНК.

31. Секвенування ДНК методом полімеразного копіювання Сенджера (метод термінуючих аналогів нуклеотидів). Характеристика векторів для секвенування ДНК.

32. Гібридизація як метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів. Гібридизація за Саузерном. Концепція STS-маркерів. Комп’ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей. Електронна ПЛР.

33. Клонування генів. Створення бібліотек генів. Векторні системи.

Методи клонування ДНК. Клонування фрагментів ДНК за сайтами рестрикції, а також з використанням адаптерів, лінкерів та коннекторів.

34. Бібліотеки та клонотеки кДНК, генів та нуклеотидних послідовностей. Клонотеки генів. Способи їх одержання. Поняття про репрезентативність

клонотеки.

35. Клонотеки геномної ДНК та кДНК. Пошук послідовностей нуклеотидів у клонотеках генів. Використання мічених зондів: гомологичні та гетерологічні зонди. Одержання бібліотек EST-послідовностей.

36. Методи скринінгу бібліотек та клонотек ДНК. Гібридизація із зондами. Використання ПЦР. Використання антитіл та функціональні тести.

37. Поняття про вектор. Вимоги до векторних молекул. Типи векторів, їх конструювання. Вектор та його ємкість. Полілінкер.

38. Функціональна класифікація векторів: экспресуючі вектори, човникові (бінарні) вектори. Властивості бактеріальних плазмід, що використовуються при конструюванні векторних молекул: здатність до автономної реплікації, контроль кількості копій, консервативність разміру, групи сумісності.

38. Створення і вивчення бібліотек геномів. Розрахунок числа рекомбінантних клонів, необхідних для отримання репрезентативної бібліотеки генома. Формула Кларка і Карбона.

39. К-ДНК - бібліотеки. Ампліфікація бібліотек. Скринінг бібліотек з метою виявлення певних генів. Створення бібліотеки геному як умова його фізичного картування та секвенування.

40. Впорядкування бібліотеки геному. "Прогулянки" по хромосомах. Методи побудови контигів та суміщених фізично-генетичних карт (енциклопедій геномів).

Питання до змістового модулю №2

1. Характеристика загальних стратегій створення рекомбінантних ДНК: метод "дробовика" (shotgun - клонування), ПЛР - клонування, клонування із використанням гетерологічних гібридизаційних проб.

2. Створення рекомбінантних молекул ДНК ДНК-лігазним та конекторним методами. Використання лінкерів.

3. Принципи конструювання культур клітин - реципієнтів для клонування рекомбінантних ДНК. Методи введення екзогенної ДНК в клітину.

4. Селекція гібридних ДНК за допомогою гібридизаційних та імунологічних методів.

8. Біологічні, хімічні, фізичні та механічні методи введення рекомбінантних ДНК у клітини. Електропорація. Способи введення ДНК у культивовані клітини тварин.

9. Перенесення генів за допомогою вірусів. Перенесення генів з використанням клітинних рецепторів.

10. Створення мікроотворів у клітинних мембранах за допомогою лазера. Мікроін’єкції. Бомбардування клітин мікрочастками. Трансфекція клітин, опосередкована фосфатом кальцію.

11.Системи експресії рекомбінантних генів.Грамнегативні бактерії та клітини дріжджів як експресуючі системи. Системи експресії на основі культури клітин тварин.

12. Вплив інтеграції клонованого гену в хромосому реципієнта на його експресію. Особливості векторів експресії для клітин дріжджів, дрозофіли, ссавців.

13. Способи досягнення високоефективної транскрипції генів, що клонуються. Характеристика промоторів, які використовують в векторах експресії. Двоплазмідні системи експресіі генів.

14. Трансляційна регуляція експресії клонованих генів. Послідовності мРНК, важливі для ефективної ініціації та термінації трансляції. Трансляційні енхансери в векторах експресії.

15. Експресія генів при перенесенні їх між різними видами прокаріотів. Експресія генів бактерій в клітинах еукаріотів.

16. Експресія генів еукаріотів в клітинах прокаріотів. Експресія генів при перенесенні їх між різними видами еукаріотів.

17. Генно-інженерне конструювання та розщеплення білків. Процедури білкової інженерії. Введення дисульфідних зв'язків, зменшення числа вільних сульфгідрильних залишків, заміни залишків амінокислот. Підходи до збільшення активності ферментів та зміни їх специфічності.

18. Пострансляційне згортання, модифікація та компартменталізація генно-інженерних білків. Секреція генно-інженерних білків та їх деградація. Підходи до мінімізації протеолізу генно-інженерних білків.

19. Основні напрямки, теоретичне та практичне значення генетичної інженерії промислових мікроорганізмів.Створення генно-інженерних штамів бактерій - продуцентів амінокислот, гормонів, інтерферонів та інших біологічно-активних сполук.

20. Основні класи дріжджових векторів: інтегративні та реплікативні плазмідні вектори, штучні хромосоми. Методи перенесення екзогенної ДНК в клітини дріжджів. Основні напрямки створення генно-інженерних промислових штамів дріжджів та міцеліальних грибів.

21. Злиття протопластів як метод конструювання і вивчення штамів мікроорганізмів.

22. Маркери для генетичної інженерії рослин. Ti-плазміди агробактерій та перенесення Т-ДНК в клітини рослин. Структура сигнальних молекул пошкодженої рослини, які активують перенесення T-ДНК.

23. Векторні молекули на основі хлоропластної та мітохондріальної ДНК, геномів вірусів та віроїдів, мобільних генетичних елементів рослин. Методи перенесення екзогенної ДНК у клітини рослин.

24. Принципова схема отримання трансгенних рослин. Етапи одержання трансгенних рослин за допомогою агробактерій.

25. Основні напрямки використання трансгенних рослин. Переваги і труднощі використання рослин як обєкта генно-інженерних досліджень. Теоретичне та практичне значення генетичної інженерії рослин, її досягнення та перспективи розвитку.

26. Феномен трансгенозу. Необхідність одержання трансгенних тварин.

Культивування тваринних клітин in vitro.

27. Вектори, що використовуються для доставки трансгенів в організм ссавців.

Шляхи отримання трансгенних тварин.

28. Методи перенесення in vitro екзогенної ДНК в тваринні клітини: пряма мікроін’єкція ДНК у пронуклеуси запліднених яйцеклітин; використання ембріональних стовбурових клітин (ES); використання рекомбінантних вірусів для зараження ембріональних клітин зародка.

29. Фактори, що впливають на експресію трансгенів в організмі трансгенних тварин. Спрямована активація та інактивація генів in vivo. Сучасні методи інактивації генів з використаннямм енхансерних, генних та промоторних ловушок.

30. Мікроін'єкції ДНК в пронуклеус запліднених яйцеклітин. Інтеграція трансгенів в хромосоми тварин. Експресія трансгенів в тваринних клітинах.

31. Методи, проблеми та перспективи клонування хребетних тварин. Використання трансгенних тварин.

32. Трансгенні тварини- біореактори («біологічні фабрики»). Трансгенні тварини з виключеними генами (генний нокаут). Трансгенні тварини як генетичні моделі спадкових захворювань.

33. Захворювання людини, до яких можна застосовувати генну терапію. Стратегії генної терапії (перенесення в клітину "здорового" гена, пригнічення небажаної функції гена, посилення імунної відповіді).

34. Вектори для генної терапії (вірусні, невірусні). Маркери в генній терапії.

Підходи до генної терапії раку.

35. Генна терапія інфекційних захворювань. Етичні проблеми генної терапії. Проблеми генетичної безпеки людини. Законодавство з питань генетичної безпеки людини.

36. Сучасні проблеми та практичне використання досягнень генної інженерії.

37. Одержання та досвід використання рослинних геномодифікованих об'єктів. Властивості, вплив на якість продуктів харчування.

38. Використання генної інженерії у тваринництві та рослинництві.

39. Використання методів генної інженерії для одержання біологично активних пептидів, гормонів, інсулина, інтерферонів.

40. Перспективи розвитку генної інженерії у XXI столітті.

Питання до диференційованого заліку

1. Предмет і задачі генетичної інженерії.

2. Головні напрямки та перспективи развитку сучасної науки. Історія виникнення та розвитку досліджень у галузі генетичної інженерії. Розвиток генетичної інженерії в Україні.

3. Генна інженерія як складова частина біотехнології. Об'єкти генної інженерії. Роль генної інженерії у розвитку біотехнології, сільського господарства, медицини, охорони природи.

4. Поняття про геном. Структурно-функціональна організація геномів вірусів, прокаріотів та еукаріотів. Особливості геному людини

5. Сучасне визначення поняття про ген. Транскрипція. Регуляторні елементи генів. Генетичний код. Схема реалізації генетичної інформації в організмі.

6. Генетичні та фізичні карти геному.

7. Мінливість геному. Поліморфні сайти рестрикції. ПДРФ-аналіз та його використання.

8. Варіабельні мікро- та мінісателітні ДНК. ДНК-фінгерпринт. Геномна дактилоскопія та її використання.

9. ПДРФ-аналіз та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) як методи аналізу геномної ДНК.

10. Ферменти, що використовуються в генній інженеріїЮ їх характеристика.

11. Властивості нуклеаз та способи їх використання в генній інженерії.

Явище модифікації-рестрикції. Системи модифікації-рестикції, їх номенклатура та генетичний контроль.Ферменти рестрикції і модифікації.

12. Системи модифікації-рестрикції класу І. Ендонуклеази рестрикції класу І та ІІІ. Ендонуклеази рестрикції класу ІІ. Характеристика сайтів впізнавання цих ферментів. Ізошизомери. Розщеплення молекул ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції класу ІІ. Умови розщеплення.

13. Основні способи використання ендонуклеаз рестрикції класу ІІ в генетичній інженерії. Принципи фізичного картування геномів. Методи побудови рестрикційних карт.

14. Отримання та аналіз макрофрагментів ДНК. Побудова РFGE-карт хромосом.Використання ендонуклеаз рестрикції для отримання та аналізу геномних фінгерпринтів, виявлення перебудов геному та точкових мутацій, підрахунку числа копій генів, вивчення білок-нуклеїнових взаємодій та генетичного поліморфізму. Поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів та його використання.

15. ДНК-лігази. Механізм лігірування ДНК Т4-ДНК-лігазою.

16. Властивості ДНК-полімераз та способи їх використання в генній інженерії. Типи нуклеазної активності. Будова та властивості ДНК-полімерази І та її Кленов-фрагмента, ДНК-полімераз фагів Т4 і Т7, термінальної дезоксинуклеотидил-трансферази. Умови синтезу ланцюгів ДНК іn vitro за допомогою ДНК-полімераз. Процесивність ДНК-полімераз.

17. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Будова сучасного ампліфікатора. Компоненти реакційної суміші, необхідні для проведення ПЛР. Властивості Taq-ДНК-полімерази. Фактори, що впливають на точність синтезу ДНК та можливості її підвищення. Специфічність та ефективність ПЛР. Стандартні умови та критичні параметри проведення ПЛР. Цикли ПЛР. Джерела ДНК для ПЛР.

18. Варіанти ПЛР (RT-ПЛР, ПЛР-in situ, асиметрична ПЛР та ін..) та їхні можливості. Ампліфікація довгих фрагментів ДНК. Методи підвищення точності ампліфікації. Практичне використання ПЛР .

19. Будова, властивості РНК-залежних ДНК-полімераз (зворотніх транскриптаз) ретровірусів, їх використання для одержання кДНК.

20. Характеристика ферментів, що використовуються при конструюванні рекомбінантних ДНК: ферменти, за допомогою яких одержують фрагменти ДНК; ферменти, що синтезують ДНК на матриці ДНК або РНК; ферменти, що з’єднують фрагменти ДНК; ферменти, які дозволяють здійснити зміну структури кінців фрагментів ДНК.

21. Етапи виділення ДНК.Особливості виділення плазмідної та вірусної ДНК.

22. Синтез ДНК та рестрикція. ДНК- рестриктази. Класи рестриктаз: часто- (4-5 п.о.), середньо-(6-8 п.о.) та рідкорозщеплюючі (8-12 п.о.). Використання сайтів рестрикції в якості генетичних маркерів ДНК. Фізичне картування ДНК. Поняття про шмер.

23. Синтез генів in vitro.Хімічний синтез олігодезоксирибонуклеотидів.

24. Методи хімічного синтезу олігонуклеотидів: фосфатдиефірний, фосфаттриефірний, фосфіттриефірний. Принцип блочного синтезу.

25. Етапи синтезу дволанцюгових фрагментів ДНК in vitro. Властивості ДНК-лігаз. Синтез Х.Кораною генів т-РНК. Синтез К.Ітакурою генів інсуліну, соматотропину. Хімічний синтез лінкерів, адаптерів, регуляторних ділянок, ДНК-зондів, праймерів, нонсенс-кодонів.

26. Ферментативний синтез генів. Властивості та особливості використання полінуклеотидфосфорилаз. Синтез к-ДНК за участю зворотної транскриптази (ревертази).

27. Комбінування хімічного та ферментативного синтезу полінуклеотидів. Монтування генів.

28. Гібридизація нуклеїнових кислот in situ. Блот-гібридизація нуклеїнових кислот. Поняття про блоттинг. Електроблотинг. Фіксація нуклеїнових кислот на фільтрах. Методи гібридизації нуклеїнових кислот: гібридизація за Саузерном, Нозерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, дот- та слот- гібридизація (етапи проведення та розрішальна здатність).

29. Напрямки використання методів гібридизації нуклеїнових кислот (ідентифікація генів та вивчення їх експресії, діагностика спадкових захворювань та інфекційних агентів, визначення спадкового поліморфізму, проведення таксономічних досліджень та геномної дактилоскопії тощо).

Створення і використання ДНК-мікрочіпів.

Основні недоліки метода блот-гібридизації.

30. Секвенування молекул нуклеїнових кислот. Методи визначення нуклеотидної послідовності РНК. Метод секвенування ДНК за допомогою специфічного хімічного розщеплення ( метод Максама і Гілберта). Отримання субстратів для цього методу. Характеристика реакцій, які використовуються для специфічної фрагментації ДНК.

31. Секвенування ДНК методом полімеразного копіювання Сенджера (метод термінуючих аналогів нуклеотидів). Характеристика векторів для секвенування ДНК.

32. Гібридизація як метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів. Гібридизація за Саузерном. Концепція STS-маркерів. Комп’ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей. Електронна ПЛР.

33. Клонування генів. Створення бібліотек генів. Векторні системи.

Методи клонування ДНК. Клонування фрагментів ДНК за сайтами рестрикції, а також з використанням адаптерів, лінкерів та коннекторів.

34. Бібліотеки та клонотеки кДНК, генів та нуклеотидних послідовностей. Клонотеки генів. Способи їх одержання. Поняття про репрезентативність

клонотеки.

35. Клонотеки геномної ДНК та кДНК. Пошук послідовностей нуклеотидів у клонотеках генів. Використання мічених зондів: гомологичні та гетерологічні зонди. Одержання бібліотек EST-послідовностей.

36. Методи скринінгу бібліотек та клонотек ДНК. Гібридизація із зондами. Використання ПЦР. Використання антитіл та функціональні тести.

37. Поняття про вектор. Вимоги до векторних молекул. Типи векторів, їх конструювання. Вектор та його ємкість. Полілінкер.

38. Функціональна класифікація векторів: экспресуючі вектори, човникові (бінарні) вектори. Властивості бактеріальних плазмід, що використовуються при конструюванні векторних молекул: здатність до автономної реплікації, контроль кількості копій, консервативність разміру, групи сумісності.

39. Характеристика загальних стратегій створення рекомбінантних ДНК: метод "дробовика" (shotgun - клонування), ПЛР - клонування, клонування із використанням гетерологічних гібридизаційних проб.

40. Створення рекомбінантних молекул ДНК ДНК-лігазним та конекторним методами. Використання лінкерів.

41. Принципи конструювання культур клітин - реципієнтів для клонування рекомбінантних ДНК. Методи введення екзогенної ДНК в клітину.

42. Селекція гібридних ДНК за допомогою гібридизаційних та імунологічних методів.

43. Створення і вивчення бібліотек геномів. Розрахунок числа рекомбінантних клонів, необхідних для отримання репрезентативної бібліотеки генома. Формула Кларка і Карбона.

44. К-ДНК - бібліотеки. Ампліфікація бібліотек. Скринінг бібліотек з метою виявлення певних генів. Створення бібліотеки геному як умова його фізичного картування та секвенування.

45. Впорядкування бібліотеки геному. "Прогулянки" по хромосомах. Методи побудови контигів та суміщених фізично-генетичних карт (енциклопедій геномів).

46. Біологічні, хімічні, фізичні та механічні методи введення рекомбінантних ДНК у клітини. Електропорація. Способи введення ДНК у культивовані клітини тварин.

47. Перенесення генів за допомогою вірусів. Перенесення генів з використанням клітинних рецепторів.

48. Створення мікроотворів у клітинних мембранах за допомогою лазера. Мікроін’єкції. Бомбардування клітин мікрочастками. Трансфекція клітин, опосередкована фосфатом кальцію.

49.Системи експресії рекомбінантних генів.Грамнегативні бактерії та клітини дріжджів як експресуючі системи. Системи експресії на основі культури клітин тварин.

50. Вплив інтеграції клонованого гену в хромосому реципієнта на його експресію. Особливості векторів експресії для клітин дріжджів, дрозофіли, ссавців.

51. Способи досягнення високоефективної транскрипції генів, що клонуються. Характеристика промоторів, які використовують в векторах експресії. Двоплазмідні системи експресіі генів.

52. Трансляційна регуляція експресії клонованих генів. Послідовності мРНК, важливі для ефективної ініціації та термінації трансляції. Трансляційні енхансери в векторах експресії.

53. Експресія генів при перенесенні їх між різними видами прокаріотів. Експресія генів бактерій в клітинах еукаріотів.

54. Експресія генів еукаріотів в клітинах прокаріотів. Експресія генів при перенесенні їх між різними видами еукаріотів.

55. Генно-інженерне конструювання та розщеплення білків. Процедури білкової інженерії. Введення дисульфідних зв'язків, зменшення числа вільних сульфгідрильних залишків, заміни залишків амінокислот. Підходи до збільшення активності ферментів та зміни їх специфічності.

56. Пострансляційне згортання, модифікація та компартменталізація генно-інженерних білків. Секреція генно-інженерних білків та їх деградація. Підходи до мінімізації протеолізу генно-інженерних білків.

57. Основні напрямки, теоретичне та практичне значення генетичної інженерії промислових мікроорганізмів.Створення генно-інженерних штамів бактерій - продуцентів амінокислот, гормонів, інтерферонів та інших біологічно-активних сполук.

58. Основні класи дріжджових векторів: інтегративні та реплікативні плазмідні вектори, штучні хромосоми. Методи перенесення екзогенної ДНК в клітини дріжджів. Основні напрямки створення генно-інженерних промислових штамів дріжджів та міцеліальних грибів.

59. Злиття протопластів як метод конструювання і вивчення штамів мікроорганізмів.

60. Маркери для генетичної інженерії рослин. Ti-плазміди агробактерій та перенесення Т-ДНК в клітини рослин. Структура сигнальних молекул пошкодженої рослини, які активують перенесення T-ДНК.

61. Векторні молекули на основі хлоропластної та мітохондріальної ДНК, геномів вірусів та віроїдів, мобільних генетичних елементів рослин. Методи перенесення екзогенної ДНК у клітини рослин.

62. Принципова схема отримання трансгенних рослин. Етапи одержання трансгенних рослин за допомогою агробактерій.

63. Основні напрямки використання трансгенних рослин. Переваги і труднощі використання рослин як обєкта генно-інженерних досліджень. Теоретичне та практичне значення генетичної інженерії рослин, її досягнення та перспективи розвитку.

64 Феномен трансгенозу. Необхідність одержання трансгенних тварин.

Культивування тваринних клітин in vitro.

65. Вектори, що використовуються для доставки трансгенів в організм ссавців.

Шляхи отримання трансгенних тварин.

66. Методи перенесення in vitro екзогенної ДНК в тваринні клітини: пряма мікроін’єкція ДНК у пронуклеуси запліднених яйцеклітин; використання ембріональних стовбурових клітин (ES); використання рекомбінантних вірусів для зараження ембріональних клітин зародка.

67. Фактори, що впливають на експресію трансгенів в організмі трансгенних тварин. Спрямована активація та інактивація генів in vivo. Сучасні методи інактивації генів з використаннямм енхансерних, генних та промоторних ловушок.

68. Мікроін'єкції ДНК в пронуклеус запліднених яйцеклітин. Інтеграція трансгенів в хромосоми тварин. Експресія трансгенів в тваринних клітинах.

69. Методи, проблеми та перспективи клонування хребетних тварин. Використання трансгенних тварин.

70. Трансгенні тварини- біореактори («біологічні фабрики»). Трансгенні тварини з виключеними генами (генний нокаут). Трансгенні тварини як генетичні моделі спадкових захворювань.

71. Захворювання людини, до яких можна застосовувати генну терапію. Стратегії генної терапії (перенесення в клітину "здорового" гена, пригнічення небажаної функції гена, посилення імунної відповіді).

72. Вектори для генної терапії (вірусні, невірусні). Маркери в генній терапії.

Підходи до генної терапії раку.

73. Генна терапія інфекційних захворювань. Етичні проблеми генної терапії. Проблеми генетичної безпеки людини. Законодавство з питань генетичної безпеки людини.

74. Сучасні проблеми та практичне використання досягнень генної інженерії.

75. Одержання та досвід використання рослинних геномодифікованих об'єктів. Властивості, вплив на якість продуктів харчування.

76. Використання генної інженерії у тваринництві та рослинництві.

77. Використання методів генної інженерії для одержання біологично активних пептидів, гормонів, інсулина, інтерферонів.

78. Перспективи розвитку генної інженерії у XXI столітті.