Определение содержания мочевой кислоты в биологических жидкостях по методу Мюллера и Зейферта. Определение общего азота в моче по методу Кьельдаля.

Задание 1. Определить содержание мочевой кислоты в сыворотке крови.

Принцип. Метод базируется на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфатно-вольфраматный реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации этой кислоты.

Ход работы. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, воды и 20% раствора ТХУ. Перемешивают, через 5 мин центрифугируют 10 мин при скорости 3000 об/мин. Берут две чистые градуированные пробирки (опытную и стандартную), прибавляют в них реактивы в соответствии со схемой.

	Опыт	Стандарт
Центрифугат (0,5 мл сыворотки)	1,5 мл	-
Стандартный раствор мочевой кислоты, 0,2 мг/мл	-	0,5 мл
20% Трихлоруксусная кислота	-	0,5 мл
Дистиллированная вода	-	0,5 мл
Насыщенный раствор натрия карбоната	0,7 мл	0,7 мл
Реактив Фолина (осторожно!)	1 капля	1 капля

Через 10 мин обе пробы фотометрируют против воды на ФЭК при длине волны 510-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Содержание мочевой кислоты (Х) в ммоль/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

Х = (Еоп.×0,01×200)/(Ест.×168), где Еоп. - экстинкция опытной пробы; Ест. - экстинкция стандартной пробы; 0,01 - масса мочевой кислоты в пробе стандартного раствора, взятого для реакции (мг); 200 - коэффициент пересчёта на 1 л сыворотки крови; 168 - молекулярная масса мочевой кислоты.

Задание 2. Определить содержание мочевой кислоты в моче.

Принцип. Метод базируется на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфатно-вольфраматный реактив (реактив Фолина) в фосфатно-вольфрамовую синь, интенсивность окраски которой пропорциональна концентрации мочевой кислоты. Количество фосфатно-вольфрамовой си-ни определяют титрованием раствором калия гексацианоферрата (III). Последний окисляет фосфатно-вольфрамовую синь, окраска которой исчезает.

Ход работы. К 1,5 мл мочи прибавляют 1 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл реактива Фолина, перемешивают и титруют раствором 0,01 моль/л калия гексацианоферрата (III) до исчезновения синего окрашивания. Для расчета содержания мочевой кислоты в моче необходимо знать, какое её количество соответствует 1 мл раствора 0,01 моль/л калия гексацианоферрата (III). Так, если на титрование 1,5 мл стандартного раствора мочевой кислоты, которая содержит 0,75 мг этой кислоты, после добавления 1 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл реактива Фолина израсходовано 0,81 мл калия гексацианоферрата (III), тогда его 1 мл отвечает: 0,75/0,81=0,8 г мочевой кислоты. Содержание мочевой кислоты (В) в мг/сут в моче рассчитывают по формуле: В = (0,8×а×в)/1,5, где 0,8 г мочевой кислоты отвечает 1 мл калия гексацианоферрата (III); а - количество калия гексацианоферрата (III), израсходованное на титрование (мл); в - суточный диурез; 1,5 - количество мочи, взятой для определения (мл). Коэффициент перерасчета в единицы СИ (ммоль/сут) составляет 0,0059.

Клинико-диагностическое значение. Мочевая кислота является конечным продуктом обмена пуриновых нуклеотидов. В норме концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,10-0,40 ммоль/л, а с мочой выделяется 2,36-5,90 ммоль/сут. Повышенное содержание мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) имеет место при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеинов (лейкозы, диабет, аллергии), при дефектах ферментов фосфорибозилдифосфатсинтетазы и гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (подагра, синдром Леша-Нихана), аденинфосфорибозил-трансферазы (мочекаменная болезнь), а также при болезни Гирке (недостаточность глюкозо-6-фосфатазы в печени). Увеличение концентрации мочевой кислоты является главным диагностическим критерием подагры. Очевидно, что при смещении реакции среды в кислую сторону, мочевая кислота откладывается в тканях, хрящах, суставных сумках. Гипоурикемия и повышенная экскреция гипоксантина и ксантина могут быть следствием недостаточности ксантиноксидазы, вызванной нарушениями в структуре гена этого фермента, или результатом повреждения печени. Гипоурикурия отмечается при подагре, нефрите, почечной недостаточности; гиперурикурия может наблюдаться при повышенном поступлении и усиленном распаде нуклеопротеинов. У детей выделяется относительно больше мочевой кислоты, чем у взрослых.

Задание 3. Определить общий азот мочи по методу Кьельдаля.

Принцип. Мочу сжигают (минерализуют) в концентрированной сульфатной кислоте. При этом азот всех органических и неорганических соединений в виде аммиака связывается с сульфатной кислотой, переходит в аммоний сульфат, который, реагируя с реактивом Несслера, образует соединение желто-оранжевого цвета. Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации азота.

Ход работы. 1. Минерализация. В пробирку наливают 0,5 мл мочи, прибавляют 0,05 мл конц. сульфатной кислоты. Сжигание осуществляют на песчаной бане: пробирка должна касаться только верхнего пласта песка. Сначала испаряется вода, моча приобретает бурую окраску. Пробирку снимают с бани, дают ей остыть, прибавляют 2 капли пергидроля и снова ставят для сжигания до обесцвечивания жидкости. Следует проверить цвет жидкости в пробирке после её охлаждения, поскольку часто жидкость, которая кажется бесцветной в горячем состоянии, во время охлаждения темнеет. После охлаждения в пробирку прибавляют 10 мл кипячёной дистиллированной воды, нейтрализуют 12,5 М едким натром до слабо щелочной реакции, которую определяют по изменению цвета лакмусовой бумажки с красного на синий. Излишек основания в случае нейтрализации приводит к помутнению раствора. Недостаточность основания вызывает выпадение солей ртути из реактива Несслера, и опыт считают испорченным.

2. Цветная реакция (несслеризация). В пробирку прибавляют 0,5 мл реактива Несслера, вследствие чего содержимое пробирки окрашивается в жёлтый цвет разной интенсивности в зависимости от содержания азота. Параллельно с опытной пробой обрабатывают стандартную: 0,2 мл стандартного раствора аммония сульфата; 0,05 мл конц. сульфатной кислоты; 0,3 мл 12,5 М раствора едкого натра; 0,5 мл реактива Несслера и 9,8 мл дистиллированной воды. Опытную и стандартную пробы измеряют против контроля при длине волны 440-450 нм в 5 мм кювете. Контроль готовят так же, как и стандартную пробу, но вместо стандартного раствора аммония сульфата прибавляют воду. Контрольная проба должна иметь лёгкий желтоватый оттенок. Более насыщенный цвет контроля свидетельствует о наличии в дистиллированной воде азота (аммиака). Расчет осуществляют по формуле: Соп.=Сст.∙ (Еоп./Ест.), где Соп. - концентрация общего азота в моче (ммоль/л); Еоп. - экстинкция опытной пробы; Сст. - концентрация общего азота в стандарте; Ест - экстинкция стандартной пробы.

Клинико-диагностическое значение. В сутки человек выделяет 10-17 г азота, из которого 80-90% приходится на мочевину. По этому показателю определяют азотистый баланс организма, а также функциональное состояние печени, почек и других органов.