Практична робота

Кількісне визначення глюкози в крові глюкозооксидазним методом

Завдання. Визначити вміст глюкози у крові глюкозооксидазним методом.

Принцип. Глюкозооксидазний метод є специфічним і широко застосовується в клініко-діагностичних лабораторіях, оскільки дозволяє визначити істинний вміст глюкози в крові в присутності різних вуглеводів та інших редукуючих речовин невуглеводної природи. Особливо доцільним є застосування глюкозооксидазного методу при діагностиці діабету та інших захворювань, пов’язаних з порушенням вуглеводного обміну. Метод базується на специфічності дії ферменту глюкозооксидази, що окиснює глюкозу до глюконової кислоти. Глюкозооксидаза – це флавопротеїн, простетичною групою якого є ФАД. Перенос двох атомів гідрогену на ФАД призводить до його відновлення, а потім ФАДН₂ передає їх на молекулярний кисень з утворенням гідроген пероксиду. Утворений гідроген пероксид в присутності ферменту пероксидази окиснює о-толідин. Відновлений о-толідин безбарвний, а окиснений – блакитно-синього кольору. Інтенсивність утвореного забарвлення прямо пропорційна концентрації глюкози і визначається на ФЕК.

Хід роботи. Кров у кількості 0,1 мл змішати у центрифужній пробірці з 1,1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Додати 0,4 мл 5% розчину цинку сульфату і 0,4 мл розчину 0,3 моль/л натрію гідроксиду. Перемішати і через 10 хвилин центрифугувати при швидкості 2500 об/хв. протягом 10 хвилин. До 1 мл надосадної рідини додати 3 мл ензимо-хромогенного реактиву (у мірну колбу на 100 мл помістити 80-90 мл ацетатного буфера [0,25 моль/л, рН=4,8], в якому розчинити 2 мг глюкозооксидази, а потім 1 мг пероксидази; додати 1 мл 1% розчину о-толідину в абсолютному спирті і довести об’єм розчину ацетатним буфером до мітки), перемішати і точно через 20 хвилин виміряти оптичну густину розчину в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі 625 нм проти контрольної проби, в яку замість надосадової рідини додати воду. Час з моменту додавання ензимо-хромогенного реактиву до вимірювання оптичної густини має бути однаковим для всіх проб. Паралельно провести визначення оптичної густини розчину стандартного зразка глюкози з концентрацією 27,8 ммоль/л, розведеної в 5 раз. Вміст глюкози у пробі розрахувати за формулою: вміст глюкози = D_досл∙С/D_ст, де D_досл – оптична густина дослідної проби; D_ст, – оптична густина розчину стандартного зразка глюкози; С – концентрація глюкози в розчині стандартного зразка.

Клініко-діагностичне значення роботи. Під час діагностування деяких хвороб (цукровий діабет, патологічні стани, які пов’язані з недостатністю функціонування печінки, нирок, ендокринопатії, новоутворення мозку, підшлункової залози і наднирникових залоз, гіповітаміноз В₁, а також низка спадкових ензимопатій) важливо мати об’єктивні уявлення про стан вуглеводного обміну, кардинальним показником якого є вміст глюкози в крові. Нормальні показники концентрації глюкози: у капілярній крові – 3,38-5,55 ммоль/л, у сироватці, плазмі крові – 4,22-6,11 ммоль/л. Збільшення концентрації глюкози в крові вище 6,1-6,6 ммоль/л – гіперглікемія – спостерігається: 1) після надмірного прийому з їжею вуглеводів – аліментарна гіперглікемія; 2) при стресі (у випадках сильного емоційного й психічного збудження); 3) при цукровому діабеті, гострому панкреатиті, панкреатичних цирозах, що пов’язано зі зниженням в організмі інсуліну; 4) при гіперфункції щитовидної залози, кори й мозкового шару наднирникових залоз, гіпофізу; 5) у випадках токсичного, травматичного, механічного пошкодження ЦНС: травма, пухлина мозку, епілепсія, менінгіт; отруєння чадним газом, ціанідами, ефіром тощо.

Зниження рівня глюкози до 2,5-2,8 ммоль/л – гіпоглікемія – зустрічається при: 1) голодуванні, незбалансованій дієті – аліментарна гіпоглікемія; 2) порушенні перетравлення й всмоктування вуглеводів внаслідок захворювання тонкого кишечнику; 3) передозуванні інсуліну при лікуванні цукрового діабету; 4) захворюванні нирок, коли порушена реабсорбція в канальцях; 5) серцевій недостатності (іноді); 6) при гіпофункції щитовидної залози, кори й мозкового шару наднирникових залоз, гіпофізу; 7) отруєнні фосфором, бензолом, хлороформом; 8) великій втраті крові; 9) гіперфункції острівців Лангерганса підшлункової залози.

**Завдання для індивідуальної самостійної роботи:

1. Відтворити схему гормональної регуляції обміну вуглеводів.

2. Підготувати реферативне повідомлення на тему «Особливості вуглеводного обміну при хворобі Іценка-Кушинга».

3. Провести огляд наукової літератури за темою «Мукополісахаридози та можливі шляхи їх корекції».