28. Методы индикации и идентификации вирусов.

Индикация вирусов

Индикацию вирусов, имеющих в суперкапсидной оболочке фермент «гемагг-лютинин», можно проводить с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Под действием вирусного гемагглютинина in vitro происходит склеивание эритроцитов. В результате формируется осадок эритроцитов с неровными, фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика». При отрицательной реакции, в случае отсутст­вия вируса в исследуемом материале, осадок эритроцитов имеет вид «пуговицы» с ровными краями. РГА - неспецифическая, несерологическая реакция. Несерологическая, т.к. в ней не участвует иммунная диагностическая сыворотка. Неспецифическая, т.к. разные вирусы могут агглютинировать эритроциты животных разных видов. В частности, вирус гриппа хорошо агглютинирует куриные и человеческие эритроциты, вирус клещевого энцефалита - гусиные эритроциты.

Индикацию вирусов можно проводить по их цитопатогеныому действию (ЦПД) на культуру клеток. Это действие выражается в повреждении монослоя за­раженной культуры клеток и изменении их морфологии (дегенерация). При этом клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Возможно образование многоядерных клеток (симпласт), в частности, под действием респираторно-синцитиального вируса. В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла - нарушение монослоя.

Методы титрования (количественное определение) вирусов.

Титрование вирусов осуществляют на различных биологических моделях.

Если вирусом заражают лабораторных животных, то единицей измерения силы (дозы) вируса будет LD50.

LD50— то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт животных определенного веса, определенного вида (иногда пола) в определенный

срок.

Если исследуемым вирусом заражают куриные эмбрионы, то титр (доза) вируса определяется в ED50 (эмбриональная доза).

ЕДзо - то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт куриных эмбрионов.

Если исследуемым вирусом заражают культуру клеток, то титр вируса измеряется в ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза) и БОЕ (бляшкообразующая единица).

ТЦДм — то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт культур клеток.

Более точным является второй метод, определяющий абсолютное количество вирусов в исследуемом материале по количеству бляшек (БОЕ), т.е. участков по гибших клеток культуры ткани под действием инфицирующего агента. Сколько образуется бляшек, столько и вирусных частиц в исследуемом материале.

Идентификация вирусов.

Идентификацию вирусов по антигенным свойствам осуществляют постановкой серологических реакций со специфическими диагностическими противовирусными сыворотками. Основными серологическими реакциями, используемыми для идентификации вирусов, являются: реакция торможения гемахтлютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток и иммуноферментный метод (ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации ГРТГА) — 2-х компонентная, сложная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) 1% взвесь эритроцитов (как индикатор).

Постановка FIT А состоит из следующих этапов: вначале соединяют вируссо-держашую жидкость с разведениями диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины и оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции производят через 1 -2 часа.

Если тип вируса соответствует типу сыворотки, то вирусный гемагглютинин будет блокироваться антителами сыворотки, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов. Такая реакция учитывается как положительная. Визуально в лунках определяется осадок эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

С другими диагностическими противовирусными сыворотками, взятыми для постановки РТГА, реакция будет отрицательной из-за несоответствия типа вируса типу сыворотки. Визуально определяется осадок эритроцитов с неровными фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика» (гемагглютинация).

РТГА применяется для идентификации вирусов гриппа, клещевого энцефалита.

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток - 2-х компонентная, слож­ная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) культура клеток (в качестве индикатора).

Постановка РН состоит из следующих этапов: вначале выделенный цитопато-генный вирус смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сы­воротками. Смеси выдерживают 1 час при комнатной температуре. Затем этими смесями заражают флаконы с культурой клеток. Если тип вируса соответствует ти­пу сыворотки, то произойдет нейтрализация вируса антителами сыворотки и куль­тура клеток будет без изменений (положительная реакция).