Научные стремления 2011-1

УДК 533.9:579.2.24 (048.8)

А.Я. Мухачѐв 1, С.В. Белов 2, Ю.К. Данилейко 2, С.М. Нефѐдов 2, Г.Г. Миллер 1

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕТЕРМАЛЬНОЙ АТМОСФЕРНОЙ ПЛАЗМЫ SHFPD СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ КЛЕТКАМИ ЧЕЛОВЕКА

1 ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, Москва

2 ООО «НЭТ» Института общей физики им. Н.М.Прохорова РАН, РФ, Москва

Актуальность. В последнее десятилетие физические методы находят всѐ большее применение как в биологии, так и в теоретической и практической медицине. Среди них большой интерес вызывает неравновесная низкотемпературная (холодная) физическая плазма, генерируемая в условиях нормального атмосферного давления и температуры окружающей среды. При взаимодействии с биологическими субстратами холодная плазма позволяет получить спектр полезных эффектов от модифицирующих и разрушающих до лечебных. Ранее мы изучали биологические свойства холодной плазмы тлеющего высокочастотного разряда в электролите (SHFPD). Была показана высокая эффективность различных настроек такой плазмы для биодеконтаминации ряда грамположительных и грамотрицательных патогенных микроорганизмов в планктонном состоянии и в биоплѐнках [1]. Применение нетермальной атмосферной плазмы является прорывом в борьбе с невозможностью преодолеть антибиотикорезистентность или неэффективность других медико-фармакологических способов терапии микробных инфекций.

Целью данного исследования было найти адекватные технологичные условия обработки злокачественных клеток для их эффективного разрушения и предотвращения последующего метастазирования в организме человека. А также изучить реакцию клеток иммунного ряда на воздействие низкотемпературной плазмы.

В настоящей работе представлены физико-химические свойства плазмы SHFPD c разными настройками, использованной для изучения механизмов еѐ взаимодействия с эукариотической клеткой.

Материалы и методы. Использовали генератор низкотемпературной плазмы «Плазмотом», выполненный по технологии коблации, (разработки ООО

«НЭТ») с плазма – химическим механизмом действия [2]. Для настроек использовали 5 металлических электродов различной конфигурации: медицинскую сталь, нержавеющую сталь, золото, платину и вольфрам, заточенных в виде карандаша или иглы. Спектрограммы плазмы этих конфигураций указывают на распределение реактивных химических компонентов (ROS), играющих определяющую роль в индукции тех или иных эффектов в биологическом субстрате. Показано наличие радикалов ОН, Н1, Нsec, HO2 , а также химических компонентов Na, H2 ,O2, N, NO, H2 O2 и незначительного количества фотонов ультрафиолета. Все компоненты являются коротко живущими и быстро преобразуются в соединения,

461

осуществляющие, в первую очередь, сильные окислительные процессы в биологическом субстрате, благодаря образованию перекиси водорода (Н2О2 ).

В качестве субстрата были взяты модельные системы клеточных культур злокачественного происхождения - монослойная культура опухолевых клеток человека HeLa и суспензионная культура трансформированных ретровирусом Т-лимфобластов человека МТ4. Клетки выращивали в лунках пластиковых планшет в питательных средах. Были выбраны 4 продолжительности обработки клеток плазмой с различными электродами: 15‖, 30‖, 60‖ и 120‖ импульсно по 15‖ во избежание перегрева электролита. Состояние культур регистрировали прижизненно в инвертированном микроскопе Diavert (Leyko, Австрия), начиная с 30 мин после обработки (немедленный эффект) и далее ежедневно (отсроченный эффект).

Результаты и обсуждение. Литературные сведения указывают на строгую зависимость получаемых эффектов от конструкции и настройки холодной плазмы при комплексном участии ROS [3, 4]. Для SHFPD плазмы нами показано, что еѐ различные конфигурации взаимодействуют с эукариотической клеткой по сходному механизму, за исключением отдельных флуктуаций, касающихся времени наступления первых морфологических изменений. Так, для клеток HeLa обработка различными электродами при малой продолжительности (15‖ и 30‖) не вызывала никаких изменений в первые 30 мин наблюдений. А отсроченные изменения, зарегистрированные через 24 или 48 час, были реверсивны с сохранением пролиферативных свойств культуры при еѐ пассировании в обычном режиме. Необратимые изменения в клетках неизменно наступали для всех испытанных электродов через 48 часов и после 60‖ и 120‖ обработки. Изменения касались блокирования деления, нарушения целостности наружной мембраны и последующем лизисе клеток (рисунки 1, 2).

Рисунок 1 - Контрольные необработанные клетки HeLa. Инвертированный микроскоп. Ув.400х

462

Рисунок 2 - Нежизнеспособные клетки HeLa с необратимыми изменениями после обработки в течение 60” или 120”. Инвертированный микроскоп. Ув. 400х

Таким образом, примененные конфигурации нетермальной атмосферной плазмы SHFPD обладают выраженным разрушающим эффектом для разных типов клеток человека со сходным или вообще одинаковым механизмом действия. Это выражалось в наступлении сильных окислительных процессов (снижении рН электролита и образовании Н2О2), отсроченном действии на генетический аппарат клетки (блокировании процессов деления) и разрушении (электропорации) клеточной мембраны с последующим лизисом клетки.

На основании этих данных можно предложить схему для обработки краѐв тканей, подлежащих вокруг удаляемой опухоли, для надѐжного удаления даже единичных раковых клеток, невидимых глазом хирурга, которые могли бы впоследствии служить источником образования метастазов.

Что касается клеток иммунного ряда МТ4, то любые режимы обработки плазмой SHFPD приводили к немедленным необратимым изменениям с последующим лизисом клеточных элементов уже в первые 30 мин.

Литературные источники

1.Мухачѐв А.Я., Сысолятина Е.В., Раковская И.В. и др., В кн.: ‖Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии …―, Гурзуф, 2011, с.186188

2.Белов С.В., Данилейко Ю.К., Нефѐдов С.М., и др., Медицинская техника, 2010,

№1, с. 1 – 6

3.Dobrynin D., Fridman G., Friedmann G., et al., New Journ. of Physics,2009, 11, 115020, p 1-26

4.Morfill G., Kong M., Zimmermann J.,et al., New Journ of Physics, 2009, 11, 115011,

p 1-8

A.J. Mukhachev 1, S.M. Belov 2 , U.K. Danileyko 2 , S.M. Nefedov 2 , G.G. Miller 1

INTERACTION OF NONTHERMAL ATMOSPHERIC PLASMA SHFPD WITH MALIGNANT YUMAN CELL LINE

463

The N.F.Gamaleya Institute for Epidemiology & Microbiology of the Russian Ministry of Health, Moscow1

OOO”NET” of N.M.Prokhorov General Physics Institute of the Russian Acad.Science, Moscow2

Summary

Nonthermal physical plasma, generating upon normal atmospheric pressure and environmental temperature (SHFPD) was investigated. Early it was demonstrated the efficient biodecontamination from some kinds of grampositive and gramnegative pathogenic microorganisms. The goal of present paper to reveal of the mechanisms of interaction this plasma with the malignant human cell, as well as with the human transformed immune T –lymphoblast MT4. As has been shown putative biophysical mechanism of SHFPD – malignant cells interaction consist in the destruction of the cell outer membrane, block of mitotic processes with the subsequent total lysis of monolayer after more than 60 sec plasma treatment.

464

УДК 616.895.8 – 071: 616.831 – 007.246].07

А.Н. Нестерович, В.Г. Объедков

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АСИММЕТРИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА В АСПЕКТЕ ДИМЕНСИОНАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ШИЗОФРЕНИИ

ГУ «Республиканский научно-практический центр психического здоровья», Минск Белорусский государственный медицинский университет, Минск

Актуальность. Данные о специфическом характере межполушарной функциональной асимметрии при шизофрении носят противоречивый характер. Клиническая систематика шизофрении в 2005 году претерпела стандартизацию

всоответствии с которой в психопатологической структуре шизофрении эксперты ВОЗ регламентируют три синдромологических оси [1]: психотизм (бред, галлюцинации), дезорганизация (позитивные формальные расстройства мышления, странное поведение), негативные симптомы (аффективное уплощение, абулия-апатия, ангедония-асоциальность, алогия). Роль индивидуального профиля функциональной асимметрии (ИПФА) в преобладании симптомов, принадлежащих к разным осям, изучена недостаточно.

Цель работы: выяснить роль межполушарной асимметрии в клиникопсихопатологической структуре шизофрении.

Задачи:

1.Сравнить ИПФА в группе больных шизофренией и в группе контроля (здоровые).

2.Сравнить ИПФА больных шизофренией различных клинических групп

всоответствии с выраженностью симптомов по трем психопатологическим осям.

Материалы и методы: Всего обследовано 90 больных с параноидной шизофренией (46 мужчин и 44 женщины) и 90 здоровых людей (59 мужчин и 31 женщина). Социодемографические показатели в группе сравнения и контрольной группе были одинаковыми (р<0,05). Для решения первой задачи больные шизофренией включены в одну исследовательскую группу, а для решения второй задачи были разделены на три группы сравнения по преобладанию у них симптоматики, принадлежащей к одной из трех психопатологических осей. Использовались: шкала для оценки негативных и позитивных симптомов (SANS/SAPS); компьютерная программа для оценки функциональной асимметрии «Психоэрготест» версии 3.74, где определялась асимметрия функций зрения (тест «карта с дырой», проба Розенбаха, тест «рассматривание в подзорную трубу»), слуха (дихотическое прослушивание), движения рук (функциональные пробы, тест точности слежения и быстроты

нажатия клавиш), с подсчетом коэффициента правого уха (КПУ) и коэффициента правой руки (КПР). Значения КПР и КПУ прямо пропорциональны степени выраженности правосторонней асимметрии, в то время как их модули отражают только степень асимметрии без учета латеральности.

465

По результатам тестирования определялся индивидуальный профиль функциональной асимметрии (ИПФА), представляющий собой сочетание ведущих руки, глаза и уха; всего выделено 18 таких сочетаний. Профиль оценивался как преимущественно правый (две их трех переменных правые), преимущественно левый (две из трех переменных левые), правый (все переменные правые), левый (все переменные левые), симметричный (две из трех переменных симметричные), и разнолатеральный (все переменные разные). Далее подсчитывалось отношение КПР/КПУ для каждого случая, отражающее тип ИПФА: всего выделено 7 типов ИПФА по аналогии с описанными Тетеркиной Т.И. [2] типами соотношений КПР/КПУ.

Таблица 1 - Типы соотношений КПР/КПУ

1тип: моторная (движение рук) и сенсорная (слух) функции локализованы в одном полушарии 1≤КПР/КПУ≤ 5

2тип: обе функции локализованы в разных полушариях, КПР по модулю превосходит КПУ не более чем в 5 раз: −5≤КПР/КПУ≤−1

3тип: функции локализованы в одном полушарии, КПР превосходит КПУ более чем в 5 раз: КПР/КПУ >5

4тип: функции локализованы в разных полушариях, КПР превосходит КПУ по модулю более чем в 5 раз: КПР/КПУ <−5

5тип: КПР = 0, т.е. моторная функция симметрична, а функция слуха локализована в левом или в правом полушарии: КПР/КПУ=0;

6тип: унилатеральная инверсия: КПУ превышает КПР, функции локализованы в одном полушарии, 0<КПР/КПУ<1

7тип: билатеральная инверсия - КПУ превышает КПР, функции локализованы в разных полушариях, −1<КПР/КПУ<0.

6,7 типы – «инверсированные», т.к. КПУ >КПР

Статистическая обработка результатов производилась с помощью программы SPSS версии10.0

Результаты и обсуждение. Исследование показало отсутствие достоверных различий между больными шизофренией и группой контроля по показателям, отражающим тип и степень асимметрии функции движения рук: у больных и у здоровых чаще ведущей являлась правая рука (48,9% и 47,8% соответственно). Средние значения КПР и модуля КПР также достоверно не различались в обеих группах (р>0,05). Аналогично, показатели асимметрии зрения не отличались в группах больных и здоровых (р>0,05).

У больных шизофренией по сравнению с группой контроля преобладала

правосторонняя асимметрия функции слуха (50% против 22%). Средние значения КПУ и |КПУ| у больных шизофренией были достоверно выше, чем у здоровых лиц (9,57±24,5% против 3,1±13,9% р<0,05 и 19,98±17,06% против

10,63±9,5% p<0,001 соответственно), что отразилось и на соотношении |КПР/КПУ|, среднее значение которого у больных шизофренией было в 2 раза меньше, чем у здоровых (2,86±4,11 против 5,08±8,31). В большинстве случаев в обеих группах сравнения (больных шизофренией и здоровых лиц) разница

466

между коэффициентами КПР и КПУ не превышала 5 раз (соответственно 54,4% и 41,1%). Это соответствовало 1 и 2 типам ИПФА. Однако 1 тип профиля (с унилатеральной локализацией функций) встречался достоверно чаще у больных по сравнению с группой контроля (30% против 20%). В то же время в группе здоровых лиц достоверно чаще, чем у больных встречались типы профилей с

выраженным преобладанием КПР над КПУ (более чем в 5 раз) (28,9% против

12,3%), что соответствовало 3 и 4 типам ИПФА. Такие отличия обусловлены значительным преобладанием 3 типа профиля (с унилатеральной локализацией функций) в группе контроля по сравнению с группой больных (17,8% против

5,6%). В группе больных шизофренией в 3 раза чаще чем в группе контроля встречались инверсивные профили (КПУ>КПР) (15,5% против 5,5%), что соответствовало 6 и 7 типам ИПФА и в основном было обусловлено преобладанием 6 типа профиля (унилатеральная инверсия) (11,1% против 3,3%). Полученные данные свидетельствуют о сглаживании разницы между степенью асимметрии слуха и движения рук у больных шизофренией, с тенденцией к инверсии этих показателей в пределах одного полушария.

Предположительно это обусловлено более высокими значениями КПУ по сравнению со здоровыми людьми при том же значении КПР.

Во всех трех клинических группах больных преобладающими являлись 1тип, 2тип, а также инверсированные типы ИПФА, что указывает на общую для любой формы шизофрении закономерность, отражающую высокие значения КПУ. Часто встречался и 5 тип, занявший по частоте второе место в группе с преобладанием негативной симптоматики; данный феномен можно объяснить тем, что в этой группе преобладала амбидекстрия рук (56,3%).

В группах больных с выраженной продуктивной симптоматикой и дезорганизацией преобладала ведущая правая рука (57,5% и 66,7% соответственно) (коэффициент Пирсона=0,245; р <0,05). Обнаружена прямая корреляция между КПУ (но не |КПУ|) и выраженностью симптомов психотизма (коэффициент Спирмана=0,303 р<0,01), а также отрицательная корреляция между КПР (и |КПР|) и клиническим типом с преобладанием негативных симптомов (коэффициент Спирмана=−0,246, р=0,02 и −0,253 р=0,02 соответственно).

Выводы:

1.Для больных шизофренией характерна тенденция к увеличению степени правосторонней асимметрии функции слуха. В основе данного феномена лежит не усиление левосторонней церебральной латерализации слухоречевых функций, а выпадение правополушарной функции – агнозия вербальных сигналов, поступающих из левой части аудиального пространства.

2.Более информативной для изучения шизофрении является оценка не самого ИПФА а его типов, определяемых по соотношению КПР/КПУ.

3.Протективным типом ИПФА для развития шизофрении можно считать 3 тип (с унилатеральной локализацией функций движения рук и слуха и выраженным преобладанием КПР над КПУ более чем в 5 раз). Данный тип встречался у здоровых лиц достоверно чаще, чем у больных шизофренией.

467

4.Детерминантами шизофренического фенотипа можно считать 1 тип ИПФА (с унилатеральной локализацией функций движения рук и слуха, КПР больше КПУ не более чем в 5 раз), а также инверсированный 6 тип. Данные типы встречались у больных достоверно чаще, чем в группе контроля и отражают степень нарушения слухоречевых функций правого полушария.

5.Продуктивная симптоматика психопатологически сопряжена с увеличением степени правой асимметрии моторных (движение рук) и сенсорных (вербальный слух) функций; последнее обусловлено прямой корреляцией с КПУ, и по этой причине она в большей степени, чем другие синдромы отражает функциональную недостаточность слухоречевых центров правого полушария. Негативная симптоматика сопряжена с уменьшением степени асимметрии моторной функции (движения рук), что свидетельствует о патогенетической разнонаправленности психопатологических осей негативной симптоматики и психотизма.

На наш взгляд, функциональные асимметрии при психических расстройствах отражают не столько латерализацию функций как некую стабильную систему, столько функциональное состояние головного мозга пациентов в целом, степень компенсации-декомпенсации психических функций, сопряженную с выраженностью дефицитарной симптоматики.

Литературные источники

1.Andreasen NC, Carpenter WT Jr, Kane JM et al. Remission in Schizophrenia: Proposed Criteria and Rationale for Consensus. American Journal Psychiatry 2005; 162: 441-449

2.Тетеркина Т.И., Доброхотова Т.А., Олешкевич Ф.В., Федулов А.С. Эпилепсия и функциональная асимметрия головного мозга. Мн, 1993 с.17-18

A.N. Nestsiarovich, V.G. Obyedkov

THE FUNCTIONAL ASYMMETRY OF BRAIN ACCORDING TO THE DIMENSIONAL MODEL OF SCHIZOPHRENIA

The Republican research and practice center of mental health, Minsk Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

The present study explored 90 schizophrenic patients and 90 healthy people. According to the three-dimensional model the patients were divided into 3 groups, depending on the prevalence of positive symptoms, negative symptoms or disorganization using SAPS\SANS estimates. Dexterity of hearing, vision and handedness were estimated. Revealed specific schizophrenic types of brain‘s asymmetry profile and the correlation between clinical type and function‘s asymmetry.

468

УДК 616.127:575.174.015.3

С.С. Ниязова 1, Н.Н. Чакова 1, Е.П. Михаленко 1, Э.В. Крупнова 1, Н.В. Чеботарева 1, С.М. Комиссарова 2, А.А. Арабей 2

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ β1 И β2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ У ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИЕЙ

1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск

2РНПЦ «Кардиология», Минск

Актуальнось. Одним из распространенных наследственных заболеваний сердечно-сосудистой системы является гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) [1]. ГКМП является одной из ведущих причин развития в молодом возрасте хронической сердечной недостаточности, острых нарушений мозгового кровообращения, фибрилляции предсердий, а также, в большинстве случаев, характеризуется неуклонно прогрессирующим течением, неблагоприятным прогнозом и высокой частотой внезапной смерти.

На сегодняшний день доказано, что ГКМП – генетически гетерогенное заболевание, обусловленное мутациями в генах, кодирующих белки, входящие в состав саркомеров кардиомиоцитов [1]. Разнообразие клинических проявлений ГКМП в значительной мере зависит от полиморфизма геновмодификаторов. Спектр возможных генов-модификаторов ГКМП включает гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, а также симпатического звена вегетативной нервной системы (СОВНС). Все основные эффекты активации СОВНС (положительный хроно- и инотропный эффекты, проводимость, возбудимость и сила сокращений сердечной мышцы) опосредуются через специфические адренорецепторы (АР), в частности, β1-АР

иβ2-АР [2-4].

Внастоящее время большое внимание уделяется изучению полиморфизмов генов β1 и β2-адренорецепторов (ADRB1 и ADRB2). Ген ADRB1 локализован на 10 хромосоме (10q24-26). Существует большое количество полиморфизмов этого гена, однако наибольшую клиническую значимость в сердечно-сосудистой патологии представляют лишь два однонуклеотидных полиморфизма: A145G, приводящий к замене серина (Ser) на глицин (Gly) в 49 позиции на амино-конце рецептора, и С1165G, обусловливающий замещение аргинина (Arg) на глицин (Gly) в 389 позиции проксимальной части карбоксиконца. Обе замены характеризуются рецессивным проявлением признака. Ген ADRB2 находится в области 5q31-32 5-й хромосомы. В кодирующей части гена выявлено 12 полиморфизмов, 5 из которых приводят к замене аминокислот:

Arg16Gly, Gln27Glu, Val34Met, Thr164Ile и Ser220Cys [5]. Наиболее изученными являются два полиморфизма: A46G, детерминирующий замену аргинина (Arg) на глицин в 16 позиции, и С79G, приводящий к замене глутамина (Gln) на глутаминовую кислоту (Glu) в 27 позиции полипептида.

Цель настоящего исследования – изучить распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов ADRB1 и ADRB2 у пациентов с различными формами ГКМП.

469

Материалы и методы. В исследование включили 157 пациентов с ГКМП (108 мужчин и 49 женщин, средний возраст 46,1±13,1 лет), среди них у 74 (47%) диагностирована обструктивная форма заболевания, у 83 (53%) - необструктивная форма. Диагноз ГКМП был верифицирован на основании наличия критериев Международного комитета экспертов по ГКМП [6].

Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли методом Mathew [7]. Методом ПЦР-ПДРФ анализа у пациентов определяли полиморфизм генов ADRB1: A145G (Ser49Gly), С1165G (Arg389Gly) и ADRB2: A46G (Arg16Gly), С79G (Gln27Glu). Использованные праймеры и эндонуклеазы представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Последовательность праймеров и характеристика аллелей анализируемых полиморфизмов

Статистическая обработка материала проводилась с использованием программного пакета ―Statistica for Windows 6.0‖.

Результаты исследования и их обсуждение. Была проанализирована частота встречаемости различных комбинаций генотипов ADRB1 и ADRB2 среди пациентов с необструктивной и более тяжелой обструктивной формами ГКМП (таблица 2).

Существует неравновесное сцепление между 49 и 389 кодонами гена ADRB1, т.е. неслучайное распределение частот аллелей по этим сайтам в результате тесного сцепления генов и наличия адаптивного преимущества конкретной комбинации аллелей [5]. Leineweber et. аl. показали, что генотип Gly49Gly всегда связан с генотипом Arg389Arg, а Gly389Gly всегда ассоциирован с Ser49Ser. Необходимо отметить, что гаплотип Gly49Gly/Gly389Gly не встречается вообще либо встречается крайне редко [8].

Полученные результаты совпадают с литературными данными:

гаплотипы Ser49Gly/Gly389Gly, Gly49Gly/Gly389Gly и Gly49Gly/Arg389Gly

отсутствовали (таблица 2). Различий по частоте встречаемости комбинаций генотипов ADRB1 у пациентов с обструктивной и необструктиной формами ГКМП не обнаружено.

В литературе также описано неравновесное сцепление между 16 и 27 кодонами гена β2-АР. Носители гомозиготного генотипа Glu27Glu практически

470