Роль цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований

тала все слои стенки кишки. Таким образом, большая степень тяжести опухолевой прогрессии связана с угнетением продукции клетками крови IL-17 (Ванхальский А. В. и др., 2012; Великая Н. В., 2013), который, согласно результатам экспериментальных исследований, проявляет способность ингибировать опухолевый рост (Benchetrit F. et al., 2002).

В литературе имеются данные о том, что IL-6 способен увеличивать дифференцировку Th17 (Jones S. A. et al., 2011),

а также уменьшать количество Th17 и увеличивать количество регулятор­ных Т-клеток опосредованно через STAT3 механизм (Erreni M. et al., 2011). Эти данные могут объяснить полученные нами результаты о сниженной способности клеток периферической крови больных колоректальным раком продуцировать IL-17 под влиянием поликлональных активаторов, что может быть связано с повышенной экспрессией IL-6 опухолью и ее микроокружением, особенно на более поздних стадиях заболевания.

Проведенное нами исследование показало, что по значению индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию клетками крови IL-17 можно с высокой степенью вероятности еще до операции судить о глубине инвазии опухоли, что является одним из наиболее существенных патогистологических пара­ метров, интересующих клиницистов (Соснина А.В. и др., 2011).

Больные раком желудка отличались от больных с хроническим гастритом и язвенной болезнью более низкими уровнями IL-17 в сыворотке. При неонкологической патологии желудка уровни этого цитокина были более высокими по сравнению со здоровыми лицами. У больных раком желудка, в отличие от больных колоректальным раком, индекс влияния ФГА на продукцию IL-17 клетками крови был более высоким и находился в прямой корреляционной связи с вариантом гистологической дифференцировки. То есть, повышенная способность клеток к продукции IL-17 в ответ на стимуляцию митогеном у больных раком желудка была характерна для опухолевой прогрессии меньшей степени тяжести (Сосни­на А. В. и др., 2009).

IL-18 – провоспалительный цитокин, принадлежащий к семейству IL-1. В активной форме он имеет молекулярную массу 18 kDa и образуется из неактивной формы с молекулярной массой 24 kDa в результате расщепления IL-1β-конвертирующим ферментом (IL-1β-converting enzyme) (Kim K. E. et al., 2009).

Этот цитокин продуцируется макрофагами, дендритными клетками, купферовскими клетками, кератиноцитами, остеобласта-

31

ми, клетками коры надпочечников, эпителиальными клетками многих тканей и органов, фибробластами и клетками микроглии (Sakai A. et al., 2008) и осуществляет свои функции с помощью рецептора – IL-18R, который состоит из α- и β-субъединиц. IL-18 является непосредственным индуктором IFN-γ, стимулирует пролиферацию и активацию Тh1 клеток, функции цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, благодаря чему обладает противоопухолевыми свойствами (Cao R. et al., 1999; Ju D. W. et al., 2001; Robertson M. J. et al., 2006; Chang C. Y. et al., 2007). Нейтрализация IL-18 предотвращает индукцию

IFN-γ (Dinarello C. A., 2000). Совместно с IL-2 этот цитокин увеличивает пролиферацию, цитотоксическую активность и продукцию IFN-γ мононуклеарными клетками крови, а кроме того, стимулирует синтез TNF-α, IL-1β и IL-8 Т-клетками и NK-клетками (Puren A. J. et al., 1998; Son Y. I. et al., 2001).

Клетки злокачественных новообразований способны самостоятельно продуцировать IL-18, который стимулирует опухолевую прогрессию. Этот цитокин принимает участие в процессе ангиогенеза, увеличивая миграцию эндотелиальных клеток, а также повышает продукцию VEGF и тромбоспонди-

на-1 (Kim K.E. et al., 2007). Кроме того, IL-18 стимулирует ин-

вазию и метастазирование, посредством увеличения синтеза матриксных металлопротеиназ клетками злокачественного новообразования и его микроокружения (IshidaY. et al., 2004), а также повышает экспрессию молекул адгезии на эндотелии сосудов, способствующих миграции опухолевых клеток. IL-18 усиливает пролиферацию клеток неоплазмы и синтез в них эндогенных кислородных радикалов, вызывающих экспрессию FasL, что приводит к Fas-опосредованному апоптозу иммунокомпетентных клеток, контактирующих со злокачественным новообразованием (Park S. et al., 2007), активирует протеинкиназы MAPK в опухолевых клетках, увеличивая инвазивность последних (Jung M. K. et al., 2006).

В нашем исследовании было установлено, что уровень IL-18 в сыворотке крови больных колоректальным раком одновременно превышал аналогичные показатели здоровых лиц. Уровень IL-18 был сопряжен с инфильтрацией опухоли лимфоцитами

(Соснина А. В. и др., 2011).

CCL2 (MCP-1) – хемокин, впервые описанный в 1983 году, относится к семейству хемокинов С–С с молекулярной массой 8–10 kDa. Хемокиновый рецептор CCR2, с которым связывается

32

CCL2, может взаимодействовать и с другими хемокинами этого семейства: CCL7, CCL8, CCL13 и CCL16 (O’Boyle G. et al., 2007),

индуцируя миграцию лимфоцитов, нейтрофилов, дендритных клеток и моноцитов/макрофагов (Volpe S. et al., 2012). MCP-1 может продуцироваться эндотелиальными клетками, астроцитами, гладкомышечными клетками, фибробластами и макрофагами под влиянием различных медиаторов: TNF-α, тромбо-

цитарного фактора роста PGF (platelet-derived growth factor) и др. (Charo I. F. et al., 1994; Sheehan J. J. et al., 2007).

МСР-1 активирует моноцитарную цитотоксическую функцию, регулирует Т-клеточную дифференцировку, в частности, стимулирует выработку Th2 цитокинов, например IL-4, который, в свою очередь, подавляет генерирование клеток Th1 типа (Ueno T. et al., 2000). Этот хемокин также синтезируется опухолевыми клетками, способствуя инфильтрации опухоли моноцитами, однако биологические эффекты МСР-1 двойственны и зависят от уровня его секреции в опухолевой ткани. Повышенная секреция МСР-1 связана с большим количеством макрофагов, инфильтрирующих опухоль, способных к ее разрушению. Вероятно, это происходит из-за мигрирующих макрофагов, приводящих в действие цитотоксический механизм, такой как индукция апоптоза или секреция высокореактивного кислорода или NO, супрессирующих опухолеассоциированные макрофаги в неоплазме (Lamagna C. et al., 2006). Опухолеассоциированные макрофаги способны стимулировать пролиферацию клеток, ангиогенез опухоли, поддерживать воспаление в очаге и тем самым ускорять опухолевую прогрессию (Mantovani A. et al., 2004). Комплекс CCL2 CCR2 активирует транскрипционные факторы MCP-1 induced protein (MCPIP) и Ets-1 на моноцитах и эндотелиальных клетках, индуцирует ангиогенез, активирует протеинкиназы МАРК, которые повышают пролиферацию, супрессируют дифференцировку и апоптоз клеток опухоли

(Jiménez-Sainz M. C. et al., 2003).

В нашем исследовании уровень MCP-1 в сыворотке крови больных колоректальным раком находился в прямой корреляционной связи с количеством патологических митозов в опухоли, которое, в свою очередь, сопряжено с глубиной инвазии, что свидетельствует о том, что уровень MCP-1 отражает степень тяжести опухолевого процесса (Соснина А. В. и др., 2011; Zhang J. et al., 2010). Моноцитарный хемотаксический протеин MCP-1, секретируемый опухолью и инфильтрирующими ее лейкоцита-

33

ми, стимулирует миграцию в очаг опухолевого роста макрофагов, которые, в свою очередь, являются источником таких ци-

токинов, как IL-8 и TNF-α (Solinas G. et al., 2009; Mantovani A. etal.,2004).Последние,обладаямощнымангиогеннымдействием, обеспечивают полноценное функционирование опухоли, а также стимулируют пролиферативную активность клеток, в том числе и опухолевых, обеспечивают их инвазию в окружающие ткани, а также миграцию в сосуды, что в конечном счете приводит к метастазированию опухоли. МСР-1 активирует моноцитарную цитотоксическую функцию, регулирует Т-клеточную дифференцировку, стимулирует выработку Th2 цитокинов

(Ueno T. et al., 2000), в частности IL-10, который, в свою оче-

редь, способен супрессировать функции иммунокомпетентных клеток (Hao N. B. etal., 2012). МСР-1 способствует пролиферации и инвазии опухолевых клеток через phosphatidylinositol 3 kinase (PI3 K)/АKT сигнальный путь (Loberg R. D. et al., 2006),

индуцирует выработку VEGF раковыми клетками, усиливая ангиогенез (Li X. et al., 2009). МСР-1 вместе с IL-6 вызывают инфильтрацию опухоли опухолеассоциированными макрофагами, которые содействуют прогрессированию новообразования, выделяя различные ростовые факторы, протеолитические энзимы и медиаторы воспаления (Roca H. et al., 2009).

Повышенные уровни МСР-1 в сыворотке у больных различными злокачественными новообразованиями связаны с увеличением стадии опухолевого процесса и находятся в прямой корреляционной связи с инфильтрацией опухоли макрофагами

(Lu Y. et al., 2006; Monti P. et al., 2003).

VEGF – это семейство широко изученных специфических регуляторов ангиогенеза, которое состоит из шести членов: VEGF-A, – B, – C, – D, – E и placenta growth factor. Они способны повышать сосудистую проницаемость и обеспечивать образование новых кровеносных сосудов в опухоли (Zhang C. et al., 2010). В обычных условиях VEGF синтезируется в небольшом количестве во многих тканях человека и животных, высокие уровни экспрессии VEGF были выявлены в местах, где необходим физиологический ангиогенез, таких как ткани плода или плаценты, а также при хронических воспалительных процессах, сахарном диабете, ишемической болезни сердца и в подавляющем большинстве опухолей человека. В частности, VEGF и его рецепторы экспрессируются в больших количествах клетками КРР и опухолеассоциированными эндотелиальными

34

клетками. Биологические эффекты VEGF зависят не только от уровня его экспрессии в клетках опухоли, но и от наличия рецепторов к нему, таких как VEGFR-1, R-2 и R-3 (Martins S. F. et al., 2011). VEGF-A, молекулярная масса которого составляет 45 Da, экспрессируется во многих опухолях человека, причем его гиперэкспрессия сопряжена с прогрессированием процесса, инвазивностью, метастазированием, плотностью сосудов в опухоли и в ее микроокружении, с низкой выживаемостью и худшим прогнозом (Neufeld G. et al., 1999). При КРР этот лиганд семейства VEGF самый обильно экспрессируемый. Он индуцирует ангиогенез через увеличение проницаемости, активации, выживаемости, миграции, инвазии и пролиферации эндотелиальных клеток. VEGF-A, а также VEGF-B играют важную роль на ранних стадиях развития аденокарцином толстого кишечника (Miyazaki T. et al., 2008). Повышенная экспрессия VEGF-C сопряжена с метастазированием в лимфатические узлы. Уровни VEGF в сыворотке крови больных при злокачественных новообразованиях толстого кишечника были значительно выше, чем у здоровых лиц (Cressey R. et al., 2005). Повышенная экспрессия VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3 выявлена на опухолеассоциированных макрофагах, на клетках опухоли,кровеносныхилимфатическихсосудах,фибробластах микроокружения (Jussila L. et al., 1998). При взаимодействии с этими рецепторами активируются различные сигнальные внутриклеточные пути, в результате чего инициируется клеточная пролиферация, выработка металлопротеиназ и миграция опухолевых клеток (Rajesh V. et al., 2003). Кроме того, VEGF

непосредственно влияет на Т-клетки памяти и может регулировать их миграцию и реактивацию, тем самым участвуя в воспалительном процессе (Basu A. et al., 2010). Была выявлена прямая корреляционная связь между концентрацией VEGF-A в плазме крови больных колоректальным раком и отдаленными метастазами (Mysliwiec P.et al., 2009), а также была установлена взаимосвязь между уровнем VEGF в сыворотке крови в предоперационном периоде и возрастом пациентов, стадией по Duke и уровнем раково эмбрионального антигена. Было показано, что величина уровня VEGF в сыворотке крови, взятой до операции, может быть использован для прогнозирования исхода операции у пациентов с колоректальным раком. После хирургического вмешательства уровень VEGF снижался по сравнению с его концентрацией в предоперационном периоде.

35

Повышение уровня VEGF после операции может свидетельствовать о рецидиве заболевания (De Vita F.et al., 2004).

Интерфероны – провоспалительные цитокины, в зависимости от структурно-функциональных особенностей подразделяющиеся на три типа. К интерферонам I типа относятся IFN-α(α-1,

α-2, α-4, α-5, α-6, α-7, α-8, α-10, α-13, α-14, α-16, α-17, α-21), IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IFN-δ и IFN-τ. IFN-α продуцируется лейко-

цитами, за исключением лимфоцитов, IFN-β – фибробластами, IFN-κ экспрессируется в кератиноцитах, пораженных вирусом, либо под воздействием IFN-β или IFN-γ, IFN-ω, на 60 % гомологичный IFN-α, также синтезируется лейкоцитами (Sen G. C., Lengyel P., 1992.; Jonasch E., Haluska F. G., 2001). Другие пред-

ставители интерферонов I типа изучены слабо. Интерфероны I типа взаимодействуют с рецептором IFN-αR, который состоит из двух субъединиц – IFN-αR1 и IFN-αR2. После взаимодействия этих цитокинов с рецепторами на мембране клеток-мишеней активируется несколько сигнальных путей, важнейшим из кото-

рых является путь Jak-Stat (O’Shea J. J. et al., 2000). Показано,

что IFN-α совместно с аденозином повышает продукцию IFN-γ NК-клетками (Jeffe F et al., 2009).

К интерферонам II типа относится только IFN-γ, продуцируемый натуральными киллерами, Т- и В лимфоцитами, специализированными антигенпрезентирующими клетками, а также натуральными киллерными Т-клетками (NKT). IFN-γ взаимодействует с двумя типами рецепторов – IFN-γR1 и IFNγR2, ассоциированными с киназами Jak1 и Jak2 соответственно и активирующими STAT1 (Benveniste E. N., Benos D. J., 1995).

К интерферонам III типа, или интерфероноподобным цитокинам, относятся IFN-λ1, IFN-λ2 и IFN-λ3, которые продуцируют-

ся лимфоцитами (Dummer R., Mangana J., 2009).

Интерфероны вызывают активацию и повышают функциональную активность нейтрофилов, натуральных киллеров, макрофагов и Т-лимфоцитов, стимулируют экспрессию антигенов MHC I и II классов, нарушают процесс ангиогенеза, а также обладают антипролиферативным действием в отношении опухо-

левых клеток (Кузнецов В. П., 1998; Boehm U. et al., 1997).

Известно, что при злокачественных новообразованиях IFN-γ способен подавлять функции натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов за счет активации ингибирующих рецепторов, таких как iNKR (Lukacher A. E., 2002). Кроме того, IFN-γ совместно с IL-10 участвует в генерации и функцио-

36

нировании CD8+ NKT-подобных клеток, обладающих иммуносупрессивной активностью (Zhou L. et al., 2008).

В нашем исследовании у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки содержание IFN-γ было более высоким, а содержание IFN-α – более низким по сравнению с соответствующими показателями здоровых лиц. Содержание IFN-γ в сыворотке крови у больных раком желудка находилось в обратной корреляционной связи с содержанием высокодифференцированных клеток в опухоли и вариантом гистологической дифференцировки. В отличие от IFN-γ, содержание IFN-α находилось в прямой корреляционной связи с содержанием высокодифференцированных клеток в опухоли. Индекс влияния ФГА на продукцию клетками крови IFN-γ находился в прямой корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах, т.е. увеличение способности клетками крови синтезировать IFN-γ связано с большей степенью тяжести опухолевой прогрессии. Характер сопряженности способности клеток крови отвечать на стимуляцию ОАА повышением продукции IFN-γ с тяжестью опухолевой прогрессии неоднозначен, так как, с одной стороны, ИВ ОАА на продукцию клетками крови IFN-γ находился в прямой корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах, а с другой – в обратной корреляционной связи со степенью васкуляризации, являющейся фактором, обеспечивающим необходимые условия для функционирования опухоли (Аутен-

шлюс А. И. и др., 2009).

При колоректальном раке процент Ki-67 позитивных клеток аденокарцином, представляющий собой показатель клеточной пролиферации, находился в обратной корреляционной связи с индексом влияния поликлональных активаторов на продукцию IFN-γ клетками крови, т.е. с увеличением пролиферативной активности опухолевых клеток происходит угнетение способности иммунокомпетентных клеток к продукции IFN-γ, который обладает рядом противоопухолевых эффектов (Аутеншлюс А. И. и др., 2011). IFN-γ играет ключевую роль в противоопухолевом иммунитете, усиливая активность натуральных киллеров, способствуя дифференцировке В лимфоцитов и синтезу ими антител, регулируя жизнедеятельность и пролиферацию Т-клеток, модулируя активность антиген-презентирующих клеток, обладая антипролиферативным и проапоптозным эффектом на многие опухоли через JAK1 или JAK2/STAT1; снижение же интерферон-продуцирующей способности клеток приводит к

37

увеличению пролиферативной активности клеток новообразова-

ния (Schoenborn J. R., Wilson C. B., 2007; Borden E. C. et al., 2007; Saha B. et al., 2010; Schroder K. et al., 2004; Ikeda H. et al., 2002; Merchant M. S. et al., 2004).

При раке желудка в тех случаях, когда содержание IFN-α в сыворотке крови было 16 пг/мл и более, у 75 % больных отсутствовали метастазы в регионарные лимфоузлы, а при более низком содержании этого цитокина в 75 % случаев они обнаруживались. Проведенные исследования позволили установить, что показатели содержания в сыворотке крови IFN-α при РЖ могут служить маркерами поражения метастазами регионарных лимфоузлов (Аутеншлюс А. И. и др., 2009). IFN-α используется при лечении меланом, показано значительное увеличение времени ремиссии у пациентов с микроскопическими метастазами в регионарные лимфатические узлы (Dummer R., Mangana J., 2009).

ГУМОРАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ЦИТОКИНОВ ПРИ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ

Влияние цитокинов на опухолевую прогрессию неоднозначно, поскольку их биологические эффекты зависят от многих факторов, в том числе и от гуморальных регуляторов их активности, к которым относятся и антитела.

Антитела к цитокинам, взаимодействующие с ними с той или иной аффинностью, выполняют разнообразные функции. Связывая цитокины, они могут нейтрализовать их биологическую активность, предотвращая соединение их с рецептором, или служить специфическими переносчиками, предохраняя цитокины от разрушения, и пролонгировать их эффект, а также модулировать индуцированные цитокинами функции иммуно-

компетентных клеток (van der Meide P. H., Schellekens H., 1997; Revoltella R. P., 1998; Phelan J. D. et al., 2008).

Антитела к цитокинам принадлежат к различным классам и субклассам иммуноглобулинов. В большинстве случаев это иммуноглобулины класса G, присутствующие в организме в пико- и наномолярных концентрациях (de Lemos Rieper C. et al., 2009). Было показано, что среди антител класса G к IL-1α около 50 % составляют антитела субкласса G4, тогда как всего на субкласс G4 приходится только 1 % от общего IgG сыворот-

38

ки крови. Антитела IgG1 и IgG2 к IL-1α могут индуцировать цитотоксические реакции против клеток, несущих связанный с мембраной цитокин (Bendtzen K. et al., 1995). Высокоаффинные нейтрализующие антитела к IFN-α, выявленные у здоровых людей, принадлежат в основном к субклассу G1, а остальные субклассы определяются в следовых количествах (Ross C. et al., 1995). Антитела к GM–CSF и IL-1α также проявляют в норме нейтрализующую активность в отношении соответствующих цитокинов (Wadhwa M. et al., 2000). Было обнаружено, что комплексы GM–CSF-IgG не взаимодействовали с рецепторами для GM–CSF на клетках, но связывались с рецептором для Fc-фрагмента IgG на полиморфноядерных лейкоцитах (Svenson M. et al., 1998). Кроме этого, у здоровых лиц определялись анти-

тела к IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, VEGF, G-CSF и IFN-γ (Hansen M. B. et al., 2007; Watanabe M. et al., 2007).

Аутоантитела к цитокинам, в частности к IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-ω, IFN-γ и GM–CSF, были выявле-

ны и при различных патологических состояниях (Грибова И. Е.

и др., 2003; Meager A. et al., 2003).

Кроме того, аутоантитела к цитокинам могут быть индуцированы при лечении соответствующими препаратами. У пациентов, в том числе и у больных раком, получавших препараты IFN-α, в сыворотке крови определялись связывающие и нейтрализующие антитела к интерферону, при этом появление последних было сопряжено с неэффективностью терапии из-за их способности отменять биологические эффекты этого цитоки-

на (Giannelli G. et al., 1994; McKenna R. M., Oberg K. E., 1997; Scagnolari C. et al., 2003). Аналогичное действие проявляли нейтрализующие антитела при лечении препаратами IFN-β (Gilli F. et al., 2004). Однако было показано, что нейтрализующие антитела к интерферонам I типа, воздействуя на эндотелиальные клетки, могут оказывать интерфероноподобный эффект (Moll H. P. et al., 2008). Появление нейтрализующих антител к IL-2 было отмечено у больных раком, лечившихся рекомбинантным IL-2, однако их наличие не было взаимосвя-

зано с эффективностью терапии (Scharenberg J. G. et al., 1994).

Аутоантитела к цитокинам оказывают то или иное влияние на опухолевую прогрессию, о чем свидетельствуют данные экспериментальных исследований, а также обнаружение их у больных со злокачественными новообразованиями. Аутоантитела к TNF-α в экспериментальной модели меланомы ингибировали

39

метастазирование опухоли (Waterston A. M. et al., 2004). У больных раком легкого и раком молочной железы в сыворотке крови были обнаружены антитела к TNF-α, повышенные уровни которых позволили предположить существование защитного механизма, направленного на нейтрализацию действия TNF-α как на опухоль, так и на прилегающие к ней ткани (Аутеншлюс А. И. и др., 2005).

Изучение гуморальных факторов регуляции биологических эффектов цитокинов в сыворотке крови больных с аденокарциномами желудка и толстой кишки и здоровых лиц показало, что и в норме, и при патологии в организме присутствуют IL-18BP, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, и аутоантитела к TNF-α, IFN-α и IFN-γ. При аденокарциномах желудка и толстой кишки было выявлено снижение уровней аутоантител класса M и субкласса G1 к TNF-α, а также повышение уровня аутоантител субкласса G4 к TNF-α по сравнению со здоровыми лицами. У больных с раком желудка по сравнению со здоровыми лицами были снижены уровни аутоантител класса М и G1 к TNF-α, в отличие от больных колоректальным раком, у которых был снижен уровень аутоантител только класса M к TNF-α. При неонкологической патологии желудка по сравнению со здоровыми лицами отмечалось повышение уровня аутоантител класса A к TNF-α. Изучение сопряженности уровней классов и субклассов аутоантител к цитокинам и IL-18BP у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки с патогистологическими параметрами опухолей показало, что содержание IL-18BP находилось в обратной корреляционной связи с количеством лимфоузлов, пораженных метастазами, уровни аутоантител субкласса G2 к TNF-α – в прямой корреляционной связи со степенью васкуляризации и в обратной – с содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли. Уровни аутоантител субкласса G3 к TNF-α также находились в обратной корреляционной связи с содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли. Следовательно, меньшая степень тяжести опухолевой прогрессии характери­ зуется более высоким уровнем гуморальных факторов регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления, хотя, судя по прямой корреляционной связи между уровнем аутоантител субкласса G2 к TNF-α и степенью васкуляризации, при этом одновременно создаются условия для обеспечения жизнедеятельности опухоли (Аутеншлюс А. И. и др., 2009).

40