Биоиндикация

• Биоиндикация - метод оценки изменений в среде при помощи биологических объектов.

• Организмы или сообщества организмов по наличию, состоянию и поведению которых судят об изменениях в среде, называются биоиндикаторами.

• С помощью биоиндикаторов можно обнаруживать места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений, а также проследить скорость происходящих в окружающей среде изменений.

• Основой задачей биоиндикации является разработка методов и критериев, которые могли бы диагностировать ранние нарушения в наиболее чувствительных компонентах природных сообществ.

Биотестирование

• Биотестирование - метод оценки токсичности среды с помощью биологических тест-объектов.

• Токсичность - свойство химических веществ проявлять повреждающее или летальное действие на живые организмы.

• Тест-объекты позволяют констатировать факт токсичности среды независимо от того, какие вещества и в каком сочетании ее обусловливают.

• Биологические организмы, используемые в качестве тест-объектов, должны обладать максимальной чувствительностью к токсическим веществам.

Биотестирование как метод оценки токсичности водной среды используется:

• при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных бытовых, сельскохозяйственных, дренажных, загрязненных природных и пр. вод с целью выявления потенциальных источников загрязнения,

• в контроле аварийных сбросов высокотоксичных сточных вод,

• при проведении оценки степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений,

• в контроле токсичности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа с целью предупреждения проникновения опасных веществ для биоценозов активного ила,

• при определении уровня безопасного разбавления сточных вод для гидробионтов с целью учета результатов биотестирования при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов (ПДС) веществ, поступающих в водоемы со сточными водами,

• при проведении экологической экспертизы новых материалов, технологий очистки, проектов очистных сооружений и пр.

Тест-объект (test organism) - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений, кормов и др.. Тест-объекты, по определению Л.П.Брагинского - "датчики" сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) водной среды ("да" или "нет"), независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ, какой обычно представляют собой сточные воды. Тест-объекты с известной степенью приближения дают количественную оценку уровня токсичности загрязнения водной среды - сточных, сбросных, циркуляционных и природных вод.

Рис.1 Ceriodaphnia affinis

Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты - ювенальные формы планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Cемидневный тест на суточной молоди  цериодафнии Ceriodaphnia affinis позволяет  за более  короткий срок (7 сут), чем на Daphnia magna (21 сут) дать заключение о хронической токсичности воды.

Рис.2 Daphnia magna

Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам.

Стандартные методики, регламентированные нормативными документами, определяют тест-объекты, которые  используются при определении токсичности тех или иных сред. В Украине в качестве стандартных приняты тесты с ветвистоусыми и жаброногими ракообразными, водорослями, инфузориями, светящимися бактериями.

Дафнии – наиболее часто используемый тест-объект для определения токсичности воды. Метод позволяет определить токсичность сточных и природных вод. Критерием острой токсичности является гибель 50% и более дафний в анализируемой воде по сравнению с контролем в течение 24, 48 или 96 ч.

Размеры этих рачков незначительны, обычно меньше 1 мм, редко до 5 мм и в исключительных случаях до 10 мм. Поэтому для изучения их строе­ния приходится пользоваться микро­скопом.

Тело дафнии (рис.3), заключено в хитиновую полупрозрачную двустворчатую раковинку, а голова вытя­нута в направленный вниз клюв, или рострум. На лобной части головы расположен непарный фасеточный глаз, возникший в результате слияния двух боковых глаз, а перед ним — простой науплиальный глазок.

Число фасеток, образующих сложный глаз, различно у разных видов и зависит от способа их питания. Под рострумом прикрепляются палочковидные обыкновенно относительно очень маленькие передние антенны. Зато задние антенны непропорционально велики по сравнению с телом. Они двуветвисты, причем каждая ветвь снабжена длинными перистыми щетинками. Задние антенны служат основным органом пере­движения ветвистоусых. Одновременно взмахивая обеими задними антеннами, рачки отталкиваются ими от волы и таким образом плывут короткими скачками. На нижней поверхности головы находится рот, окруженный спереди верхней губой, с боков жвалами и сзади челюстями.

Рис.3 Строение дафнии:

1-передняя антенна; 2-задняя антенна; 3-науплиальный глазок; 4-фасеточный глаз; 5-кишечник; 6-сердце; 7-яичник; 8-эмбрионы в выводковой сумке; 9-брюшко; 10-грудная ножка

Грудной отдел ветвистоусых укорочен и судя по количеству пар ножек, состоит из 4-6 сегментов. Он, как уже указыва­лось, помещается внутри двустворчатой раковины, но у самок между спинной по­верхностью тела и спинным краем рако­вины имеется обширная полость, выпол­няющая роль выводковой сумки. В эту сумку откладываются яйца, и при благо­приятных условиях там же они развиваются.

У большинства ветвистоусых ракообразных грудные ножки слу­жат для отфильтровывания мелких взве­шенных в воде частиц, которыми рачки питаются. В соответствии с этим лопасти грудцых ножек снабжены многочислен­ными перистыми щетинками, образующи­ми вместе фильтрационный аппарат. Нож­ки совершают до 300 -500 взмахов в 1 ми­нуту. Из пяти пар грудных ножек Дафнии фильтруют только третья и четвертая. При движении первой пары ножек вперед вода поступает в филь­трующую камеру. В это время третья и четвертая пары изгибаются вперед, обес­печивая дальнейший ток воды. Отфиль­трованные пищевые чистицы поступают в брюшной желобок. Пятая пара ног огра­ничивает сзади фильтрующую камеру. Делая взмах назад, она вместе с четвертой парой вызывает выводящий ток воды. Таким образом, между грудными ножками дафнии функции разделены, что говорит о большей их специализации. Ближайшие к основанию наружные ло­пасти грудных ног фильтрующих ветвистоусых ракообразных превращены в жабры. По системе полостей кровь поступает в жабры и обогащается в них кислородом.

До тех пор пока условия жизни ветвистоусых рачков благоприятны, в водоемах встречаются только самки, откладывающие и вынашивающие в своих выводковых камерах неоплодотворонные яйца. Число этих яиц различно не только у разных видов, но даже у различных особей одного вида. Разные виды дафний образуют до 50 или даже до 100 яиц на самку. Яйца развиваются в выводковой камере матери, где из них образуются сначала подвижные эмбрионы, а затем вполне сформировавшиеся маленькие рачки, покидающие выводковую камеру и приступающие к самостоятельному существованию. Летом при достаточном количестве пищи, рождение молоди и появление в камере новых яиц происходят каждые 1- 2 дня, благодаря чему численность ветвистоусых может очень быстро увеличиваться.

Вышедшая на свободу молодь часто линяет и быстро растет. Первые три линьки проходят через 1-1,5 суток, а следующие через 2-3 суток. Большинство видов достигает половозрелости после 3-4-ой линьки, т. е. через 2-6 дней после рождения. Так получаются новые поколения самок, продолжающие размножаться партеногенетически.

Но если условия существования ветвисто­усых рачков ухудшились вследствие по­нижения температуры, уменьшения коли­чества пищи или загрязнения водоема. Это ухудшение сейчас же скалывается на судьбе яиц, находящихся в половых путях самки. Ее спинной край становится толще, под раковиной собираются клетки, плотным слоем окружающие яйцо или яйца. У дафний поверх этих клеток выделяется хитиновая оболочка и в выводковой камере возникает так называемое седлышко, или эфиппиум (рис. 4), содержащее обычно два яйца. Формирование эфиппиума продолжается 2-3 дня, и самка носит его в течение 1-2 дней. Затем она линяет, и эфиппиум оказывается на свободе. Благодаря присутствию воздухоносного слоя эфиппиумы дафний плавают на поверхности воды.

Такие яйца в эфиппиуме помогают рачкам пере­носить всевозможные неблагоприятные условия; они вмерзают в лед, высыхают, сохраняя в течение длительного времени жизнеспособность. В то же время они слу­жат средством расселения ветвистоусых, легко переносясь из водоема в водоем вет­ром, вместе с илом, присохшим к лапкам водоплавающих птиц, т. д. Благодаря своим покоящимся яйцам ветвистоусые широко распространены во всех стоячих водоемах нашей планеты.

Рис.4 . Эфиппиум

Культура дафний. Исходный материал желательно приобрести в специальных учреждениях и организациях.

При поддержании культуры в помещении не должно быть вредных газов и токсичных паров. Оптимальная температура 20 ± 2°С, продолжительность светового дня 12-14 ч. (не освещать культуру прямыми солнечными лучами). Посуду для содержания дафний нельзя мыть моющими и органическими растворителями, лучше мыть питьевой содой, при особом загрязнении – хромовой смесью или соляной кислотой. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, предварительно отстоянную не менее 7 суток и насыщенную кислородом (pH = 7,0 – 8,2; жесткость общая – 3-4 мг-экв./л; концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л). Раз в 7-10 суток половину объема воды с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют скопившийся на дне осадок и при большой плотности (более 25 самок) культуру прореживают. Не следует производить аэрацию воды в сосудах.

Кормом для дафний служат хлебопекарные дрожжи. Для приготовления дрожжевого корма берут 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают отстояться в течение 30 мин. Надо садочную жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1-2 раза в неделю.

Также используют в качестве корма для дафний водоросль Хлореллу. Водоросли для кормления выращивают в стеклянных емкостях при 12-16 часовом освещении лампами дневного света, при температуре от 22 до 25^оС, на питательной среде Прата. Питательные растворы готовят на дистиллированной воде. Состав среды Прата, г/дм³ – нитрат калия – 0,1; K₂HPO₄×3H₂O – 0,01; MgSO₄×7H₂O –0,01; FeCl₃×6H₂O – 0,001.

В приготовленную питательную среду добавляют 1-5 мл суспензии водорослей Chlorella vulgaris. При выращивании необходимо 2-3 раза в день встряхивать питательный раствор с водорослями. После того, как окраска питательной среды становится интенсивно зеленой (требуемая плотность клеток водорослей 1,5×10⁶ клеток/см³), водоросли отделяют от культивационной среды центрифугированием или отстаиванием в холодильнике (от +2 до +2,5^оС) в течение 7-14 дней с последующим отделением осадка. Суспензию водорослей хранят в холодильнике, не допуская замораживания. Для использования в качестве корма суспензия хранится до 30 суток.

Изобильное кормление может привести к потере чувствительности, недостаточное питание – к неадекватному реагированию на воздействие токсичных веществ. Кормят маточную культуру ежедневно или через день водорослевой суспензией и один раз в неделю дрожжевой суспензией. Перед кормлением температуру водорослевой и дрожжевой суспензий доводят до комнатной.

Биотестирование морских вод проводят используя культуру Artemia salina.

Определение общей токсичности основывается на сравнении результатов гибели личинок (науплиусов) артемий в тестируемой воде и воде, отобранной в условно чис­том районе, которую использовали в качестве контроля. За критерий токсичности при­нимают количество погибших личинок в опытных образцах за 72 ч.

Методика проведения экспериментов включает в себя: подготовку тест-объекта к биотестированию, определение пригодности культуры Artemia salina к биотестирова­нию, проведение биотестирования и математическую обработку результатов биотести­рования.

Особенностью применения метода биотестирования является то, что он требует отдельной подготовки тест-объекта к проведению экспериментов. Для проведения экс­периментов используют личинки артемии на стадии второго ортонауплиуса, которая развивается из сухих яиц на третьи сутки культивирования. Стадия второго ортонауплиуса выбрана как наиболее подвижная и наиболее чувствительная относительно различного рода загрязнений. Для получения второго ортонауплиуса сухие яйца A. salina помещают в отстоянную водопроводную воду из расчета 1 г сухой массы на 100 мл воды. Уже через 30 мин пустые оболочки яиц, всплывшие на поверхность, удаляют де­кантированием. Отобранные таким образом жизнеспособные яйца еще в течение суток выдерживали в пресной воде при периодическом аэрировании. Через сутки культуру промывают фильтрованной морской водой с соленостью 17 ‰ и pH воды 8,0...8,5 и помещают в чистую фильтрованную морскую воду, где и выдерживают в течение двух суток для развития рачка до стадии второго ортонауплиуса, пригодного для биотести­рования. Образование ортонауплиусов из яиц происходит через определенные стадии развития (рисунок 5). Весь цикл преобразования яиц контролируют под микроскопом. После­довательность смены стадий развития изображена на рис. 5.

Рис. 5. Стадии развития ортонауплиуса из яйца

Непосредственно перед биотестированием необходимо проверить пригодность ли­чинок артемий для использования их в качестве тест-объекта в экспериментах. Пригод­ность культуры A. salina к проведению экспериментов определяют по реакции рачков на разные концентрации раствора калия двухромовокислого (K₂Cr₂O₇) в целях выявления средней летальной концентрации (CL50) эталонного вещества, которое вызывает гибель 50 % личинок в течение 24 ч. Для этого готовят серию растворов в диапазоне концен­траций 4..10,0 мг/л. Проверку пригодности проводят в трех повторностях для каж­дой концентрации. По окончании эксперимента подсчитывают количество погибших ли­чинок в каждой концентрации и каждой повторности относительно контроля.

Отбор пробы. Пробу природной (сточной) воды отбирают объемом до 1 л. До биотестирования возможно хранение ее не более 6 часов при температуре 4°С.

Далее пробу фильтруют через фильтровальную бумагу и заливают в емкости для биотестирования.