Генотипирование
Задачи
Идентификация и классификация бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, относятся к числу ключевых задач как прикладной, так и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии [Spratt 1999, Tenover 1997]. Эпидемиолог должен быть готов ответить на два достаточно различных типа вопросов:
1) Являются ли штаммы изолированные в конкретном очаге заболевания идентичными, генетически родственными или не взаимосвязанными? Это задача краткосрочного и локального эпидемиологического расследования. Результатом такого расследования должно стать устранение возбудителя инфекции из окружающей среды, определенных продуктов и других источников инфекции, включая людей.
2) Как связаны штаммы, циркулирующие на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другие годы? Это задача долгосрочного и глобального эпидемиологического анализа. Итогом анализа должно стать выяснение закономерностей распространения, циркуляции и эволюции патогенных штаммов и клонов и создание методов эпидемиологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности [Черкасский 1993].
Классические серологические методы типирования
Наибольшее распространение получили серологические методы классификации, основанные на выявлении антигенных детерминант молекул, представленных на бактериальной поверхности, - полисахаридов, белков, липополисахарида и т.д. [Swaminathan 1996, Koroleva 1998]. Как уже было сказано, менингококки подразделяются на серогруппы (по полисахариду), серотипы и серосубтипы (по белкам наружной мембраны), иммунотипы (по липополисахариду), пневмококки - на серотипы, гемофильная палочка - на серотипы (по полисахариду), из которых наиболее вирулентен серотип b.
Принципиальное достоинство данного подхода связано с тем, что, как правило, поверхностные макромолекулы патогенных бактерий, в том числе возбудителей ГБМ, являются, с одной стороны, факторами вирулентности, обуславливающими возможность колонизации организма человека и генерализации инфекции, и, с другой стороны, - мишенью для специфических и неспецифических защитных систем человека [Spratt 1999, Grifiss 19955, Платонов 1999a]. Поэтому определение серогрупп, серотипов, иммунотипов бактерий позволяет предсказать исход их взаимодействия с системами врожденного и приобретенного, в том числе вакцинального, иммунитета и является существенным элементом эпидемиологического надзора.
Ограничения серологических методов. Взаимодействуя с системами иммунитета, поверхностные молекулы подвержены сильнейшему селекционному давлению. Механизмы, приводящие к фазовым вариациям, мутациям, рекомбинациям, горизонтальному переносу генов [Spratt 1999] обеспечивают широкую вариабельность поверхностных макромолекул и приводят к отсутствию четкой взаимосвязи иммунотипа штамма с его эволюционным происхождением и клональной принадлежностью: родственные штаммы могут иметь различные серотипы в то время как, штаммы, имеющие одинаковый серотип, не обязательно являются эволюционно близкими [Achtman 2001].
Существенным ограничением серологических методов типирования является необходимость выделения живой культуры бактерий, что далеко не всегда возможно. Кроме того, реагенты для серотипирования (специфические антитела) в России не выпускаются, а стоимость зарубежных реагентов велика. Поэтому серотипирование возбудителей ГБМ проводится в России редко и только в исследовательских целях [Koroleva 1998]. Отечественные реагенты для серогруппирования менингококков выпускаются и серогруппирование должно проводиться [Приказ № 375].
Генотипирование по одному гену
К этой группе относятся методы, основанные на амплификации определенного гена с помощью ПЦР и дальнейшей идентификации ампликона. Способы идентификации: гель-электрофорез (специфический ампликон должен иметь определенную длину и соответствующую электрофоретическую подвижность); рестрикционный анализ (ампликон подвергается действию ферментов-рестриктаз, нарезающих его на характерное число фрагментов определенной длины); ПЦР с иммуноферментным детектированием (аналог ИФА при котором ампликон связывается со специфическим зондом); и другие.
Подобные методы активно внедряются в практику как недорогие и технически несложные методы экспресс-анализа и диагностики [Swaminathan 1996, Платонов 1999в, Платонов 1999г]. Экспресс-методы способны обнаружить лишь ограниченное число вариаций гена, но ампликон можно характеризовать полностью путем его дальнейшего прямого секвенирования. Тем не менее, любые методики, работающие только с одним геном, априори упускают потенциально существенную информацию и, следовательно, недостаточно пригодны для классификации бактерий и филогенетических исследований.
ПЦР-технологии для идентификации серогруппы менингококка, рассмотренные в предыдущем разделе, также фактически являются технологиями генотипирования по одному гену. Поскольку антигенные свойства белков наружной мембраны класса 1 и классов 2/3, характеризующие серотип и серосубтип менингококка, также определяются соответствующими генами, возможно серотипирование и серосубтипирование на основе ПЦР-технологий.
Генотипирование по всему геному
К этой группе относятся гель-электрофорез в пульсирующем поле (ППГЭ), ПЦР-амплификация со случайными праймерами или праймерами, комплементарными повторяющимся последовательностям.
При ППГЭ весь геном бактерии подвергается действию набора ферментов-рестриктаз, а затем фрагменты характеризуются путем электрофореза в меняющемся во времени и пространстве электрическом поле; в результате каждый фрагмент занимает в геле позицию, зависящую от его длины.
Случайные праймеры или праймеры, комплементарные повторяющимся последовательностям, - это короткие праймеры, связывающиеся с большим количеством участков бактериального генома. В результате амплификации получается большое количество ампликонов, число и длина которых определяется числом и позицией потенциальных мест связывания праймеров в бактериальном геноме. Затем фрагменты характеризуются по подвижности в гель-электрофорезе.
Формальной характеристикой штамма, исследованного методами ППГЭ или ПЦР со случайными праймерами, является электрофоретическая картина-паттерн, т.е. специфический набор полос на электрофореграмме препарата ДНК штамма. Паттерн практически уникален, то есть если при сравнении двух штаммов получаются одинаковые паттерны - это указывает на их идентичность [Swaminathan 1996, Achtman 2001, Bevanger 1998]. Различие в электрофоретических паттернах двух штаммов однозначно указывает на различие их геномов. В этом преимущество данных методов, когда нужно проследить эпидемическую цепочку и установить источник заражения.
Ограничение данных методов в том, что различие в электрофоретических паттернах непосредственно не раскрывает природы, локализации и биологического смысла различия, требующего исследования иными методами. Так, например, "молчащая" мутация, не приводящая к замене аминокислоты и изменению свойств белка, вполне может привести к изменениям, выявляемым методами ППГЭ или ПЦР со случайными праймерами. Методы получения паттернов трудно стандартизовать, а степень их различия не всегда пропорциональна реальной степени различия штаммов. Эти методы не рекомендуется использовать для анализа долгосрочной эволюции возбудителей ГБМ или сравнения штаммов, циркулирующих на разных территориях [Tenover 1997, Spratt 1999].
Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ)
Основные принципы МЛСТ таковы.
1. Выбирается ограниченное количество (от 6 до 10) бактериальных генов, предпочтительно "нейтральных", не кодирующих известные факторы вирулентности или патогенности, но являющихся маркерами филогенетического родства. В исследуемой популяции каждый ген должен встречаться в достаточном числе аллелей (более десяти). Желательно, чтобы вариации в данных генах накапливались медленно, а обладание тем или иным аллелем маркерного гена само по себе не обуславливало явных эволюционных преимуществ штамма. Этому условию соответствуют гены цитоплазматических ферментов, отвечающих за внутриклеточный метаболизм.
2. Для каждого исследуемого штамма нуклеотидные последовательности выбранных генов (или их участков) определяются методом прямого секвенирования. Каждая уникальная последовательность определяет аллель локуса. Набор аллелей исследуемых локусов конкретного штамма определяет его сиквенс-тип (СТ). Эволюционные взаимосвязи различных СТ и генетическое расстояние между ними оценивается с помощью существующего специализированного программного обеспечения.
3. В Интернете поддерживаются общедоступные веб-сайты, содержащие базы данных об известных уникальных последовательностях и соответствующих им СТ. Автор, проведший МЛСТ-анализ конкретного штамма, может с помощью вышеупомянутой базы данных классифицировать обнаруженный СТ как известный или новый, а также внести свои результаты в общемировую базу. В общемировой базе хранятся в стандартизованной форме индивидуальные сведения о каждом штамме, включающие СТ и, если известно, данные о типировании другими методами (серологическими и пр.) и эпидемиологические данные (страна выделения, источник изолята - например, СМЖ - и пр.). Таким образом, со временем проясняется взаимосвязь между МЛСТ и традиционными методами типирования.
4. В силу специфики методов получения и хранения информации о СТ, данные, получаемые различными лабораториями, абсолютно сопоставимы. В перспективе это позволит провести глобальный эпидемиологический анализ распространения штаммов в разное время, на различных территориях, среди пациентов с различными патологиями, и т.д. и т.п.
К настоящему дню созданы МЛСТ-технологии для генотипирования основных возбудителей ГБМ - Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae.
Рассмотрим практическую реализацию данного подхода применительно к типированию менингококков.
1. В МЛСТ анализ включены 7 генов: adk (функция кодируемого белка - аденилаткиназа), gdh (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа), aroE(шикимат дегидрогеназа), abcZ (предположительно - ABC переносчик), pdhC (субъединица пируват дегидрогеназы), pgm(фосфоглюкомутаза), fumC (фумарат гидратаза).
2. К настоящему времени изучена коллекция более, чем из 1200 штаммов менингококков. В коллекции были представлены штаммы: выделенные в различное время (с 1917 года по 2000 год) в разных странах всех континентов; различных серогрупп и серотипов; представляющие как "гипервирулентные", эпидемически значимые подгруппы менингококков, так и эндемичные штаммы.
3. Внутренние фрагменты названных генов размером приблизительно в 450 пар оснований амплифицированы с помощью специфической ПЦР и секвенированы; детали процедуры приведены в [Maiden 1998] и на веб-сайте http://mlst.zoo.ox.ac.uk. Выделено более 500 различных СТ. Дендрограмма генетического родства (на основе матрицы попарных различий аллельных профилей), построенная по методу UPGMA, объединяет эти СТ в несколько больших кластеров (Рис. 2).
4. На дендрограмме родства по МЛСТ в первую очередь четко отличаются менингококки серогруппы А от менингококков серогрупп В и С (Рис. 2). Это подтверждает современные представления о том, что для популяции менингококков группы А характерна клональная структура, в то время как среди менингококков групп В и С имеет место интенсивный процесс рекомбинаций и горизонтального переноса, в том числе и генов, ответственных за синтез капсулы В или С, что приводит к достаточно быстрому размыванию клональной структуры.
5. На дендрограмме родства по МЛСТ (Рис. 2) могут быть четко выделены так называемые гипервирулентные подгруппы (субгруппы I, III и IV менингококков серогруппы А, а также ET-5 и ET-37 комплексы, А4 кластер и "ветвь 3" менингококков серогрупп В и С [Платонов2000a, Платонов 1999в]). Выделяется также ряд устойчивых субгрупп группы А, имеющих меньшее эпидемическое значение (субгруппы V, VI, X и др.)
6. Результаты генотипирования методом МЛСТ и методом ПЦР-амплификация со случайными праймерами в принципе совпадают, хотя последний метод более подвержен влиянию "шумов", вызванных несущественными мутациями. Также результаты генотипирования методом МЛСТ совпадают с результатами, полученными с помощью популярного ранее за рубежом, но чрезвычайно трудоемкого и доростоящего метода мультилокусного энзимоэлектрофореза, обсуждение которого выходит за рамки данного пособия [Tenover 1997].
Преимущества МЛСТ. Во-первых, МЛСТ имеет дело с однозначно идентифицированными изменениями нуклеотидных последовательностей. Во-вторых, МЛСТ можно проводить непосредственно амплифицируя соответствующие локусы из клинического материала (крови, спинномозговой жидкости, и т.п.) без выделения и хранения бактерий, что сокращает время и позволяет провести типирование в отсутствии жизнеспособного возбудителя, например, после антибиотикотерапии, или типирование так называемых "некультивируемых форм" бактерий. В-третьих, как методика определения СТ, так и форма их представления и анализа поддаются почти абсолютной стандартизации, позволяя сопоставлять и интегрировать данные независимо работающих лабораторий в единый, общедоступный с помощью сети Интернет массив. В результате мы имеем четкую характеристику клонов возбудителей ГБМ, циркулирующих на данной территории в данное время, и можем ее сопоставить с характеристикой клонов, выделенных ранее или на других территориях.
Существующие ограничения метода в принципе преодолимы. Разделяя все множество патогенных менингококков (или пневмококков и т.д.) на несколько больших субгрупп и ограниченное число сиквенс-типов, метод МЛСТ не всегда может с достаточной точностью проследить пути эволюции и распространения сменяющих друг друга штаммов и клонов. Развитие метода МЛСТ должно пойти по линии включения в анализируемый набор также и генов, кодирующих "факторы вирулентности и патогенности", в том числе вариабельных генов, что придаст результатам большую осмысленность с точки зрения эпидемиологии и патогенеза заболеваний, вызываемых изучаемыми инфекционными агентами. В настоящий момент это сдерживается достаточно высокой стоимость прямого секвенирования (затраты на характеристику одного штамма можно оценить в 200-300 долларов). Но с развитием генетических технологий стоимость МЛСТ снижается и будет продолжать снижаться, что в непосредственном будущем поможет ввести этот метод в рутину специализированных лабораторий.
Целевое типирование по нескольким генам
Одним из ключевых элементов МЛСТ является то, что оно проводится во всех лабораториях мира по стандартной процедуре с одним и тем же набором генов. Однако, более детальный молекулярно-эпидемиологический анализ может потребовать изучение и других генов для более точной дискриминации различных генотипов. Эпидемические клоны менингококков серогруппы А было предложено дополнительно характеризовать по вариабельным генам, кодирующим белки tbpB (трансферрин-связывающий белок), iga (IgA-протеаза), opaB и opaD (так называемые "белки непрозрачности") и вставочному элементу IS1106. Аллели данных белков сначала были изучены путем прямого секвенирования, затем были подобраны рестриктазы, позволяющие дифференцировать аллели с помощью более быстрого и дешевого метода ПЦР с рестрикционным анализом [Achtman 2001].
Преимущества и ограничения метода: применяется для уточняющего, детального типирования, но не для базового генотипирования.
Применение генотипирования для характеристики менингококков в Москве
Применив МЛСТ-методологию и метод амплификации со случайными праймерами к анализу коллекции менингококков группы А, изолированных в 1969-97 годы в Москве от больных менингококковой инфекцией, нам удалось показать, что за этот период произошло по меньшей мере три смены клона, превалирующего на данной территории (см. Таблицу 5). В 1969-77 годах преобладали менингококки субгруппы III, МЛСТ-тип СТ-5. В 1983-85 годах преобладали менингококки субгруппы X и присутствовали менингококки субгруппы VI. Менингококки субгруппы III исчезли. В 1986-93 годах выявлялись только менингококки субгруппы VI. Для 1994-95 годов наиболее типичны штаммы субгруппы VI, однако встречаются и единичные изоляты субгрупп III и X. В 1996-97 годы вновь отмечается полное преобладание менингококков субгруппы III, однако имеющих CT-7 МЛСТ-тип [Achtman 2001].]. Подобные резкие смены превалирующих клонов не были характерны для менингококков серогрупп В и С, популяции которых была крайне гетерогенны в 1983-1997 годы во время спада вызванной ими заболеваемости [Кoroleva 1998].
Таблица 5.