Олигонуклеотиды для определения принадлежности бактерий к родам Neisseria, Streptococcus и Haemophilus на основе гена 16s рнк.

Род бактерий, с геномом которого взаимодействует праймер	Сокра-щенное название праймера	Последовательность оснований в праймере  (5’-3')
Neisseria, Streptococcus, Haemophilus и многие другие эубактерии	LU3	AACT(C/A)CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
Neisseria	NSN	AAGCAATCAGGTTGCCCAACAGCTAA
Haemophilus	HIN	ACAAGCTCATCTCTGAGCTCTTCTTAGG
Streptococcus	STN	CTGAGACTGGCTATAAGAGATTAGCTTGC

Специфические "серогрупповые" праймеры (Таблица 2) распознают следующие гены менингококков: для серогруппы А - уникальный ген, кодирующий УДФ-N-ацетил-d-глюкозамин-2-эпимеразу (mynA), для серогрупп В и С - гены, кодирующие полисиалилтрансферазу-D (siaD).Эти гены участвуют в синтезе полисахаридов капсулы менингококков. С помощью специализированных программ FASTA и BLASTA не было обнаружено гомологии выбранных праймеров с нуклеотидными последовательностями других бактерий и эукариотических организмов. Праймеры выбраны таким образом, чтобы обеспечить не менее 4-5 несовпадений с негомологичными нуклеотидными последовательностями генов siaD, то есть способны дискримировать менингококки серогруппы B от менингококков серогруппы C (а также W135, Y, и других). Праймеры теоретически способны определить серогруппу менингококка более, чем в 90% случаев заболевания, поскольку менингококки групп А, В и С суммарно ответственны более чем за 90% случаев МИ в России [Koroleva 1998]. Результат ПЦР с серогрупповыми праймерами является дополнительной проверкой и подтверждением верности результатов, полученных с родоспецифическими праймерами.

Таблица 2.

Олигонуклеотиды для определения серогрупповой принадлежности n. Meningitidis на основе генов, участвующих в синтезе капсулы.

Определяемая серогруппа	Сокращенное название праймера	Последовательность оснований в праймере  (5’-3')
А	GA1	GCCAGAGGAAGCAAATAGGCGTT
A	GA2	GAGCGGAATCACAAAAGAGAATGTTG
B	GB1	TGGTGGAAAACACTGAAATGATCCA
B	GB2	TCGATTACTCTCCGCGTGTACCTTG
C	GC1	CCTGAATATGGTAACAATTAATCCCCGT
C	GC2	CTTGTTGGGCTGTATGGTGTATCGAATC

Условия амплификации для определения родовой принадлежности возбудителя

Амплификацию ДНК проводится в 25 мкл раствора, содержащего 15 пМ общеродового LU3 праймера, 15 пМ праймера, специфичного для стрептококка и по 10 пМ праймеров для менингококка и гемофильной палочки. Для повышения эффективности амплификации используется техника “горячего старта”: смесь праймеров (2.5 мкл) и дезоксинуклеотидтрифосфатов (2.5 мкл раствора дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ производства “Sigma”, США, каждый в концентрации 2 мМ) изолируется от остальных компонентов реакционной смеси перегородкой из воска. В верхний компартмент добавляется 5 мкл 5-кратного раствора для проведения ПЦР (содержащего TRIS, рН 8.0, 0,335 М, “Sigma”; MgCl₂, 15 мМ; бычий сывороточный альбумин 0,625 г/л, “Sigma”; 40% глицерина; 0.0625% ксиленцианола, “Serva”, ФРГ); 0,5 мкл термостабильной рекомбинантной Taq-полимеразы “ДиаТак” (производство ЦНИИЭ, г. Москва) в концентрации 5 ед/мкл; 4.5 мкл деионизованной воды; 10 мкл исследуемого образца (раствора ДНК, полученной из СМЖ или культуры бактерий). Амплификация нескольких образцов одновременно проводится на многоканальном амплификаторе. В дополнительные пробирки, предназначеные для контроля реакции, вместо исследуемой пробы добавляют отрицательный контроль “К-” – буфер для элюции ДНК из набора для выделения ДНК и положительный контроль “К+” - раствор ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, H.influenzae. При проведении диагностических исследований отрицательный контроль К-, также как и отрицательный контроль выделения В-, рекомендуется ставить через каждые 10 исследуемых образцов.

Рекомендуемые оптимальные параметры ПЦР составляют: денатурация пробы при температуре 95⁰ С в течение 2 мин, далее 40 циклов (95⁰С – 20 сек, 67⁰С– 20 сек, 72⁰С– 40 сек) с последующим прогреванием реакционной смеси при 72⁰С в течение 1 минуты.