Условия амплификации для определения серогрупповой принадлежности менингококков

Для определения серогрупповой принадлежности N. meninigitidis ПЦР проводится со смесью трех пар олигонуклеотидов в одной пробирке с целью экономии реактивов и времени проведения исследования. В 25 мкл реакционной смеси содержится по 10 пМ каждого из 6 праймеров. Остальные компоненты реакционной смеси такие же, как и при определении родовой принадлежности микроорганизмов. Оптимальная процедура ПЦР для серогруппирования состоит из: денатурации пробы при температуре 95⁰ С в течение 2 мин; собственно циклов амплификации 95⁰С – 10 сек, 60⁰С– 10 сек, 72⁰С– 10 сек; последующего прогревания реакционной смеси при 72⁰С в течение 1 минуты. Число циклов зависит от анализируемого материала: при постановке ПЦР на ДНК штаммов проводится 40 циклов, на образцах СМЖ - 42 цикла амплификации. В качестве положительного контроля используют растворы ДНК N.meningitidis серогрупп А, В, и С.

Анализ и учет результатов

Продукты амплификации выявляются и дифференцируются методом электрофореза в 1.8% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Длина амплифицированного фрагмента гена 16S РНК Neisseria – 341 пар нуклеотидов, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus– 792 п.н., длина специфических ампликонов N. meningitidis серогруппы А – 349 п.н., группы В – 539 п.н., С- 209 п.н. (Рис. 1). Фиксацию, хранение и анализ полученных изображений гелей удобно проводить с помощью специализированных систем обработки изображения (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНИИ эпидемиологии); однако при небольшом объеме исследований возможна и непосредственная визуальная оценка и/или фотографирование результатов.

Учет результатов. В дорожке (или дорожках) соответствующей положительному контрольному образцу (или образцам) должна быть яркая специфическая светящаяся полоса на уровне длин ампликонов, указанных выше. Длина ампликона определяется по дополнительной дорожке, содержащей маркеры длины. Положительными считаются образцы (клинические пробы), которые содержат специфическую светящуюся, большей или меньшей интенсивности, полосу на том же уровне (Рис.1). Отрицательными считаются образцы, в дорожках которых нет подобных полос. В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу, не должно быть высокомолекулярных полос (выше уровня 100 п.н.)

Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

• Если в дорожке, соответствующей положительному контролю, отсутствует специфическая полоса. Причиной могла явиться ошибка в подготовке реактивов, постановке ПЦР или сбой программы амплификатора.

• Если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса, значит, произошла контаминация реактивов или проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР (без пробоподготовки) для выявления источника контаминации. Если недостоверный результат повторился хотя бы один раз, необходимо сменить реактивы.

Метрологические понятия и терминология

Диагностическая ценность нового теста, в данном случае ПЦР, определяется в сопоставлении с "классической" диагностикой, в данном случае бактериологической. Результаты сопоставления могут быть представлены в виде таблицы, подобной Таблице 3, исходя из которой вычисляется специфичность "нового" теста относительно "стандартного" теста, равная, в процентах, 100*ИО/(ИО+ЛП), и егочувствительность, равная 100*ИП/(ИП+ЛО). Очевидно, что специфичность тем больше (лучше), чем меньше число ложно-положительных результатов; чувствительность тем больше (лучше), чем меньше число ложно-отрицательных результатов.

Таблица 3.