Вывод (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

ЗАНЯТИЕ 4

ТЕМА: Ферменты 3. Номенклатура и классификация ферментов. Медицинская энзимология.

Цель занятия: Сформировать представления о принципах номенклатуры и классификации ферментов, основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче.

Исходный уровень знаний и навыков:

Студент должен знать:

1. Строение клетки и основных органелл

2. Понятие о мутациях и механизмах мутагенеза Основные этапы биосинтеза белка

3. Принципы и методы измерения скорости химических реакций

Студент должен уметь:

1. Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.

Структура занятия:

1. Теоретическая часть:

   1. Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерные ферменты. Органоспецифические ферменты. Выделение и очистка ферментов. Качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов. Номенклатура и классификация.

   2. Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне.

   3. Изменение активности ферментов в онтогенезе.

   4. Основные направления клинической энзимологии.

      1. Энзимопатии. Определение. Классификация. Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений при энзимопатиях. Степень клинических проявлений энзимопатий. Вторичные (приобретенные) - токсические, алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений. Клинические проявления.

      2. Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот, и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер- и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики.

      3. Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно- сосудистых и онкологических заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы и их применение.

      4. Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов.

      5. Использование ферментов в промышленности и производстве.

2. Практическая часть(выполнение лабораторной работы):

   1. Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

Литература основная:

1. 1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 126-132, М., Медицина, 1998, стр. 157-168.

3. 3. Николаев А. Н. Биологическая химия , М., Высшая школа, 1989, стр. 52-92.

дополнительная:

4. 4. Р. Марри и др. "Биохимия человека", М., Мир, 1.1993, том 1, стр. 63-75.

5. 5. Филиппович Ю. Б. "Основы биохимии" М., Высшая школа, 1993, стр. 105-144.

6. 6. Ташев Т (ред.). Врожденные и приобретенные энзимопатии. М., Медицина, 1980.

7. 7. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М., Медицина, 1981.

8. 8. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Киев, Выща школа, 1990, стр. 167-186

9. 9. Зилва Ф., Пеннел Дж. Клиническая химия в диагностике и лечении. М., Медицина, 1986, стр.372-388.

ЗАДАЧИ

1. Изоферменты ЛДГ различаются по:

а) электрофоретической подвижности	г) субстратной специфичности
б) Km для ПВК
в) числу субъединиц	д) органной локализации

2. Какие из свойств ферментов плазмы крови можно использовать с целью диагностики?

а) молекулярную массу и его электрофоретическую подвижность

б) значение K_mдля субстратов

в) чувствительность к действию активаторов и ингибиторов, а также к условиям среды.

г) энергию активации

д) оптимум pH

3. О каких заболеваниях свидетельствует увеличение активности перечисленных ферментов в плазме крови?

АСТ	а) Костные заболевания
АЛТ	б) Острый гепатит
Щелочная фосфатаза	в) Холестаз
Кислая фосфатаза	г) Аденома простаты
5-нуклеотидаза	д) Инфаркт миокарда

4. Ингибиторами каких ферментов являются указанные соединения:

Диизопропилфторфосфат	а) ДНК-полимераза
Парахлормеркурийбензоат	б) Ацетилхолинэстераза
Малонат	в) Ферменты с каталитически активной SH-группой
Фторурацил	г) цитохромоксидаза
Цианид	д) сукцинат-ДГ

5. В структуру каких ферментов входят соединения?

FAD+	а) пируваткарбоксилаза
пиридоксальфосфат	б) ЛДГ
ТПФ (кокарбоксилаза)	в) АСТ
биотин	г) оксидаза аминокислот
NAD+	д) ПВК декарбоксилаза

Практическая часть:

Лаборатоpная работа № 1: Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

ХОД РАБОТЫ: Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи (см. табл.).

В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. После перемешивания содержимого, пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45°С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу:

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024
Гидролиз крахмала

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.