ІНСУЛІН БИЧАЧИЙ

Insultnum bovinum

H - Phe - Val - Asn - Gin - His - Leu - Cys - Gty - Ser - His - Leu - Val -

10

Glu - Ala - Leu - Tvr - Leu - Val - Cvs - Gly - Glu - Arq - Gly - Phe -

20

Phe - Tvr - Thr - Pro - Lvs - Ala - OH

зо

Інсулін бичачий є натуральною антидіабетичною речовиною, одержаною із підшлункової залози биків або корів та очищеною.

Вміст:

— інсулін бичачий (C2^ffS7TN650T5S6) у сумі із А21 дезамідоінсуліном бичачим: від 93.0 % до 105 %, у

перерахунку на суху речовину.

Умовно, для маркування препаратів інсуліну, приймають, що 0.0342 мт інсуліну бичачого відповідає 1 МО інсуліну.

ВИРОБНИЦТВО

Тварини, від яких одержують інсулін бичачий, мають витримувати вимоги щодо здоров'я тварин, яких використовують для споживання людиною.

ВЛАСТИВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору.

Розчинність. Практично не розчинний у воді Р та 96 % спирті Р. Розчиняється у розведених мінеральних кислотах і із розкладанням у розведених розчинах гідроксидів лужних металів.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

A. Переглядають хроматограму, одержану у випробуванні «Кількісне визначення».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчину час утримування основного піка має співпадати із часом утримування основного піка на хроматограмі розчину порівняння (с).

B. Пептидне картування.

Випробовуваний розчин. Готують розчин 2.0 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.0! Мрозчині кисюти

хлористоводневої. 500 мкд одержаного розчину переносять у чисту пробірку та додають 2.0 мл MEPES буферного розчину рИ 7.5 Р і 400 мкл розчину 1 мг/ мл протеази Staphylococcus aureus штам V8. тип VXI1-B Р. Пробірку закривають та інкубують при температурі 25 °С протягом 6 год. Реакцію зупиняють додаваням 2.9 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р.

Розчин порівняння. Готують аналогічно випробовуваному розчину, замість випробовуваної субстанції додають ФСЗ інсуліну бичачого.

Випробування проводять методом рідинної хроматографії (2.2.29).

—рухома фаза В: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 400 мл води Р, 400 мл ацетонітрилу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

Швидкість рухомої фази: Імл/хв.

Детектуванння: спектрофотометрично за довжини хвилі 214 нм.

Урівноваження колонки: не менше 15 хв за вихідних умов. Хроматограму холостого розчину одержують, використовуючи наведений више градієнт.

Об'єм інжекції: 50 мкл.

Придатність хроматографічної системи: хроматограми випробовуваного розчину та розчину порівняння мають співпадати із хроматограмою інсуліну бичачого, що додається до ФСЗ інсуліну бичачого. На хроматограмі розчину порівняння ідентифікують піки, що відповідають фрагментам I, II і III. Коефіцієнт симетрії для піків, що відповідають фрагментам II і ПІ. має становити не більше 1.5. Коефіцієнт розділення лля цих 2 піків має с т а н о в и т и не менше

1.9.

Результати: хроматографічний профіль випробовуваного розчину має відповідати хроматографічному профілю розчину порівняння.

ПРИМІТКА: час утримування фрагмента І однаковий для інсуліну свинячого та інсу. ііну. *>одського. Часи

утримування фрагментів іі і IVоднакові для всіх інсулінів. Час утримування фрагмента НІ однаковий для інсуліну бичачого та для інсуліну свинячого.

ВИПРОБУВАННЯ

Домішки із молекулярною масою, більшою за молекулярну масу інсуліну. Ексклюзивна хроматографія (2.2.30). Використовують метод внутрішньої нормалізації.

Розчини зберігають при температурі (2-10) °С і використовують протягом 7 діб. Якщо використовують автоматичний інжектор, розчини зберігають при температурі (2-10)° С.

Випробовуваний розчин. 4 мг випробовуваної субстанції розчиняють в 1.0 мл 0.01 М.розчину кислоти хлористоводневої.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. Використовують розчин інсуліну (близько 4 мг/мл), що містить більше 0.4 % високомолекулярних білків. Можуть бути використані лікарські засоби інсуліну для ін'єкцій, такі як розчин або суспензія, освітлені певною кількістю б Мрозчину кислоти хлористоводневої, що містять визначений відсотковий вміст високомолекулярних білків, або розчин субстанції інсуліну в 0.01Мрозчині кислоти хлористоводневої. Інсулін, що містить визначений відсотковий вміст високомолекулярних білків, може бути приготований із субстанції інсуліну, витриманої при кімнатній температурі протягом 10 діб.

Колонка:

—розмір: 0.3 м х 7.5 мм,

—нерухома фаза: силікагель гідрофільний для хроматографії І5 (5-10 мкм), підхожий для розділення мономерів інсуліну від димерів і полімерів.

Рухома фаза: кислота оцтова льодяна Р - ацетонітрил Р - розчин 1.0 г/л аргініну Р (15:20:65). Одержану суміш фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 0.5 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 276 нм.

Урівноваження колонки: нову колонку перед використанням врівноважують шляхом повторного хроматографування розчину інсуліну, що містить високомолекулярнї протеїни. Для цього розчин для перевірки придатності хроматографічної системи хроматографують не менше 3 разів. Колонка вважається врівноваженою, якщо для двох послідовних інжекцій одержано однакові результати.

Об'єм інжекції; 100 мкл.

Час хроматографування: близько 35 хв.

Часи утримування: полімерні комплекси інсуліну — (13-17) хв, ковалентний димер інсуліну — близько 17.5 хв; мономер інсуліну — близько 20 хв, солі — близько 22 хв.

Придатність хроматографічної системи: розчин для перевірки придатності хроматографічної системи:

Інсулін бичачий

—хроматографічна система вважається придат-

ною, якщо відношення Ир до Hv не менше 2.0, де НГ — висота піка димеру над базовою лінією, Нг — висота над базовою лінією найнижчої точки хроматограми між піком димеру та піком мономєру.

Нормування: сума площ піків із часом утримування меншим, ніж час утримування основного піка становить не більше 1.0 % суми площ піків. Не враховують піки із часом утримування більшим, ніж час утримування піка інсуліну.

Супровідні білки. Рідинна хроматографія (2.2.29). як описано у випробуванні «Кількісне визначення». Використовують таку програму:

Розчини витримують при температурі (2-10) °С і використовують протягом 24 год. Придатність хроматографічної системи (коефіцієнт розділення, лінійність) перевіряють, як описано у випробуванні «Кількісне визначення». Якщо необхідно, коригують співвідношення рухомих фаз для забезпечення повного виходу А21 дезамідоінсуліну свинячого перед початком градієнта. Профіль градієнта може бути відкорегований для забезпечення повного виходу всіх супровідних домішок інсуліну.

Хроматографують 20 мкл розчину порівняння (с)

і20 мкл випробовуваного розчину. Якщо необхідно, коригують об'єм інжекції у межах від 10 мкл до 20 мкл залежно від виконання вимог ізлінійності, як описано в розділі «Кількісне визначення». Хроматографують протягом близько 50 хв. На хроматограмі розчину порівняння (с) А21 дезамідоінсулін бичачий виявляється як невеликий пік після основного піка

імає відносний час утримування по відношенню до основного піка близько 1.3.

На хроматограмі випробовуваного розчину площа піка А21 дезамідоінсуліну бичачого не має перевищувати 3.0 % суми площ усіх піків; сума площ усіх піків, крім піків інсуліну бичачого та А21 дезамідоінсуліну бичачого, не має перевищувати 3.0 % суми площ усіх піків.

Бичача проінсуліноподібна імунореактивність (PLI). Не більше 0.001 % (10 ррт). у перерахунку на сулу речовину.

Використовують імунохімічний метод із підхожою чутливістю (2.7.1), наприклад кількісне визначення радіоімунологічним методом. Для калібрування використовують Міжнародний Стандартний Реактив проінсуліну бичачого.

Цинк. Не більше 1.0 %, у перераху нку на суху речовину.

Атомно-абсорбційна спектрометрія (2.2.23, метод І).

Випробовуваний розчин. 50.0 мг субстанції розчиняють у 0.01 Мрозчині кисюти .хлористоводневоїта

доводять об'єм розчину тією самою кислотою до 25.0 мл. Якщо необхідно, доводять 0.01 Мрозчином кисюти хюристоводневоїдо необхідної концентрації (наприклад, від 0.4 мкг/мл Zn до 1.6 мкг/мл 2п).

Розчини порівняння. Свіжоприготованї розчини, шо містять 0.40 мкг/мл Zn, 0.80 мкг/мл Zn, 1.00 мкг/мл Zn. і.20 мкг/мл Zn, 1.60 мкг/мл Zn, готують відповідними розведеннями еталонного розчину цинку (5мг/мл Zn) Р 0.01 Мрозчином кислоти хлористоводневої.

Джерело випромінювання: лампа із порожнистим цинковим катодом.

Довжина хвилі: 213.9 нм.

Полум'я: повітряно-ацетиленове підхожого складу (наприклад, 11 літрів повітря та 2 літри ацетилену за хвилину).

Втрата в масі при висушуванні (2.2.32). Не більше 10.0 %. 0.200 г субстанції сушать при температурі 105 °С протягом 24 год.

Сульфатна зола (2.4.14). Не більше 2.5 %, у перерахунку на суху речовину. Визначення проводять із 0.200 г субстанції.

Бактеріальні ендотоксини (2.6.14). Менше 10 МО/мг, якщо субстанція призначена для виробництва лікарських засобів для парентерального застосування без подальшої процедури видалення бактеріальних ендотоксинів.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Випробовуваний розчин. Субстанцію розчиняють у 0.01М розчині кислоти хлористоводневої до концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (а). Вміст віали ФСЗ інсуліну людського розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої до концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (Ь). Вміст віали ФСЗ інсуліну свинячого розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хігористоводневоїдо концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (с). Вміст віали ФСЗ інсуліну бичачого розчиняють у 0.01 Мрозчині кисюти хлористоводневої до концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (d). 1.0 мл розчину порівняння (с) доводять 0.01 Мрозчином киаготихюристоводневої

до об'єму 10.0 мл.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. Змішують 1.0 мл розчину порівняння (а) і 1.0 мл розчину порівняння (Ь).

Розчини зберігають при температурі (2-10) °С і використовують протягом 48 год. Якщо використовують автоматичний інжектор, розчини зберігають при температурі (2-10) °С.

Колонка:

— розмір: 0.25 м х 4.6 мм,

Рухома фаза: рухома фаза А - рухома фаза В (42:58). Якщо необхідно, коригують склад суміші.

Наведені нижче розчини готують і зберігають при температурі не нижче 20 °С:

—рухома фаза А: 28.4 г натрію сульфату безводного Р

розчиняють у воді Рі доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 1000 мл; додають 2.7 мл кислоти фосфорної Р; якщо необхідно, доводять до рН 2.3 етаноламіном Р, фільтрують і дегазують;

—рухома фаза В: змішують 550 мл рухомої фази А та 450 мл ацетонітрилу Р. Одержаний розчин нагрівають до температури не нижче 20 °С для запобігання утворенню осаду (змішування рухомої фази з ацетонітрило.м є ендотермічним процесом); фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 214 нм.

Придатність хроматографічної системи:

—коефіцієнт розділення: хроматографують 20 мкл розчину для перевірки придатності хроматографічної системи та 20 мкл розчину порівняння (Ь). Час хроматографування розчину для перевірки придатності хроматографічної системи має становити не менше часу, необхідного до повного виходу основного піка на хроматограмі розчину порівняння (Ь). На хроматограмі розчину для перевірки придатності хроматографічної системи ідентифікують піки, відповідні інсуліну свинячому та інсуліну людському. Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо коефіцієнт розділення для піків інсуліну людського та інсуліну свинячого становить не менше 1.2. Якщо необхідно, для досягнення належного розділення регулюють співвідношення рухомих фаз А і В;

—лінійність: хроматографують 20 мкл розчину порівняння (с) і 20 мкл розчину порівняння (d). Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо площа основного піка на хроматограмі розчину порівняння (с) становить (10x0.5) площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (d). Якщо ця умова не виконується, коригують об'єм інжекції в межах від 10 мкл до 20 мкл залежно від ступеня лінійності сигналу детектора.

Об'єм інжекції: 20 мкл випробовуваного розчину.

Вміст інсуліну бичачого C^Hj^N^O^S, у сумі із А21 дезамідоінсуліном бичачим визначають, використовуючи площу основного піка та площу піка А21 дезамідоінсуліну бичачого на хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння (с) і зазначений вміст інсуліну бичачого у сумі із А21 дезамідоінсуліном бичачим у ФСЗ інсуліну бичачого.

ЗБЕРІГАННЯ

У повітронепроникному контейнері, у захищеному від світла місці, при температурі нижче — 20 °С до використання у виробництві. Після розморожування інсулін зберігають при температурі (5±3) °С і використовують у виробництві протягом короткого періоду часу. Для запобігання абсорбції вологи повітря при зважуванні інсулін перед відкриванням контейнера має бути витриманий при кімнатній температурі.

І Н С У Л І Н Д В О Ф А З О В И Й д л я І Н ' Є К Ц І Й

Insulinum biphasicum iniectabile

INSULIN INJECTION, BIPHASIC

Інсулін двофазовий для ін'єкцій має відповідати вимогам статті «Інсулінулікарські засоби для ін'єкцій» та наведеним нижче вимогам.

Інсулін двофазовий для ін'єкцій є стерильною суспензією кристалів інсуліну бичачого у розчині інсуліну свинячого.

ВЛАСТИВОСТІ

Суспензія білого або майже білого кольору. Під мікроскопом більшість частинок виглядають як ромбоедральні кристали, що мають розмір від кута до кута через кристал більше 10 мкм, але зрідка перевищують 40 мкм.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Переглядають хроматограму, одержану у випробуванні «Кількісне визначення».

На хроматограмі випробовуваного розчину піки двох інсулінів мають відповідати основним пікам на хроматограмі відповідного розчину порівняння.

Інсулін двофазовий для ін'єкцій

ВИПРОБУВАННЯ

рН (2.2.3). Від 6.6 до 7.2.

Інсулін у надосаловій рідині. Від 22.0 % до 28.0 %. Визначення проводять, як описано у статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій».

Загальний цинк. Від 26.0 мкг/100 МО інсуліну до 37.5 мкг/100 МО інсуліну. Визначення проводять, як описано у статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій».

ІНСУЛІН ІЗОФАНОВИЙ ДВОФАЗОВИЙ ДЛЯ ІН'ЄКЦІЙ

Insulinum isophanum biphasicum iniectabile

INSULIN INJECTION, BIPHASIC ISOPHANE

Інсулін ізофановий двофазовий для ін'єкцій має відповідати вимогам статті «Інсуліну лікарські засоби для ін 'єкцій», за винятком випробування «Інсуліну надосадовій рідині», із урахуванням додаткових вимог, зазначених нижче.

Інсулін ізофановий двофазовий для ін'єкцій є стерильною забуференою суспензією свинячого або людського інсуліну, у комплексі із протаміну сульфатом або іншим підхожим протаміном у розчині інсуліну одного із цих видів.

ВИРОБНИЦТВО

Інсулін ізофановий двофазовий для ін'єкцій готують, як описано у статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій».

Інсулін ізофановий двофазовий для ін'єкцій одержують змішуванням у певних співвідношеннях розчину інсуліну для ін'єкцій та інсуліну ізофанового для ін'єкцій. Ці співвідношення мають бути зазначені у маркуванні та контролюватися методом, встановленим компетентним уповноваженим органом.

ВЛАСТИВОСТІ

Суспензія білого або майже білою кольору, при відстоюванні якої утворюється білий або майже білий осад і безбарвна або майже безбарвна надосадова рідина; осадлегко ресуспендується при обережному струшуванні. Під мікроскопам частинки виглядають як стрижнєподібні кристали, більшість яких мають