СИРОВАТКА ПРОТИДИФТЕРІЙНА

Immiinoserum diphthericum

DIPHTERIA ANTITOXIN

ВИЗНАЧЕННЯ

Сироватка протидифтерійна (дифтерійний антитоксин) — препарат, що містить сироваткові глобуліни. здатні специфічно нейтралізувати токсин, утворений Corynebacterium diphtheriae.

ВИРОБНИЦТВО

Одержують фракціонуванням сироватки коней або інших ссавців, імунізованих проти дифтерійного токсину.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Специфічно нейтралізує токсин, утворений С. diphtheriae, знешкоджуючи його для сприйнятливих до нього тварин.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Не менше 1000 МО протидифтерійної сироватки на мілілітр, якщо вона одержана із сироватки коней, і не менше 500 МО протидифтерійної сироватки на мілілітр, якщо одержана з сироватки інших ссавців.

Активність протидифтерійної сироватки визначають шляхом порівняння дози, необхідної для захисту мурчаків або кроликів від еритрогенних ефектів, викликаних фіксованою дозою дифтерійного токсину, з кількістю стандартного препарату протидифтерійної сироватки, необхідної для отримання такого самого захисту. Для цього порівняння потрібен стандартний препарат протидифтерійної сироватки, калібрований у Міжнародних одиницях(МО), і підхожий для використання як тест-токсин препарат дифтерійного токсину. Активність тест-токсину визначають відносно стандартного препарату; актив- НІСТЬ випробовуваної протидифтерійної сироватки визначають тим самим методом відносно активності тест-токсину.

Міжнародна одиниця протидифтерійної сироват- ки—це специфічна активність нейтралізації проти дифтерійного токсину, яка міститься в зазначеній кількості міжнародного стандартного препарату, що складається з певної кількості висушеної імуносироватки коня. Еквівалент Міжнародних одиниць міжнародного стандартного препарату встано&тює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

Сироватка протидифтерійна

Приготування тест-токсину. Дифтерійний токсин готують із культури С. diphtheriae. отриманої у рідкому середовищі. Культуру фільтрують для отримання стерильного токсичного фільтрату і зберігають при температурі 4 °С.

Вибір тест-токсину. Для вибору токсину для використання як тест-токсин визначають Іг/100 лозу і мінімальну реактивну дозу для мурчаків або кроликів. спостерігаючи за тваринами протягом 48 год. Тест-токсин має містити не менше 200 мінімальних реактивних доз в Іг/100 дозі.

Мінімальна реактивна доза. Це найменша кількість токсину, яка при внутрішньошкірній ін'єкції мурчакам або кроликам протягом 48 год на місці ін'єкції викликає слабку типову реакцію.

Тест-токсин витримують протягом декількох місяців перед застосуванням у кількісному визначенні протидифтерійної сироватки. Протягом цього періоду токсичність зменшується, і можна збільшувати Іг/100 дозу. Через часті інтервали визначають мінімальну реактивну і Іг/100 дози. Після експериментального підтвердження стабільності Іг/100 дози тест-токсин вважається готовим до застосування і може використовуватися протягом тривалого періоду. Тест-токсин зберігають у захищеному від світла місці при температурі від 0 °С до 5 °С. Стерильність підтримують, додаючи толуол або інший антимікробний консервант, який не викликає швидкого зниження специфічної токсичності.

Визначення тест-дози токсину (Іг/100 дози). У підхожій рідині готують розчин стандартного препарату, що містить 0.1 МО протидифтерійної сироватки на мілілітр.

Готують суміші розчинів стандартного препарату й розчину тест-токсину: кожна містить по 1.0 мл розчину стандартного препарату, один із розташованих послідовно об'ємів розчину тест-токсину, і доводять загальний об'єм підхожою рідиною до 2.0 мл. Суміші витримують при кімнатній температурі в захищеному від світла місці протягом від 15 хв до 60 хв. Для кожної суміші використовують двохтварин. Кожній з них удепільований бік внутрішньошкірно вводять по 0.2 мл суміші. За тваринами спостерігають протягом 48 год.

Тест-доза токсину — це його мінімальна кількість у 0.2 мл суміші, частково нейтралізована стандартним препаратом, щодає слабке, але характерне ураження в точці введення у вигляді еритеми.

Визначення активності протидифтерійноїсироватки.

Готують розчин стандартного препарату в підхожій рідині, що містить 0.125 МО протидифтерійної сироватки на мілілітр.

Готують розчин тест-токсину в підхожій рідині, що містить 12.5 тест-доз на мілілітр.

Готують суміші розчину тест-токсину та випробовуваної протидифтерійної сироватки: кожна містить по 0.S мл розчину тест-токсину, один із розташо-

ваних послідовно об'ємів випробовувано» протидифтерійної сироватки, і доводять загальний об'єм підхожою рідиною до 2.0 мл. Також готують суміші розчинів тсст-токсину і розчину стандартного препарату. що містять по 0.S мл розчину тест-токсину. один із розташованих послідовно об'ємів розчину стандартного препарату, центрованих за об'ємом у 0.S мл. який містить 0.1 МО. і доводять загальний об'єм підхожою рідиною до 2.0 мл. Суміші витримують при кімнатній температурі в захищеному від світла місці протягом від 15 хв до 60 хв. Для кожної суміші використовують двох тварин. Кожній з них

удепільований бік внутрішньошкірно вводять по

0.2мл суміші. За тваринами спостерігають протягом 48 год.

Суміш, що містить найбільший об'єм протидифтерійної сироватки, який не здатний захистити мурчаків від еритематозних ефектів токсину, містить 0.1 МО. Цю кількість використовують для розрахунку активності протидифтерійної сироватки у Міжнародних одиницях на мілілітр.

Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо на всіх ділянках ін'єкцій сумішей з 0.8 мл або менше розчину стандартного препарату спостерігаються еритематозні ураження, а на ділянках ін'єкцій сумішей. що містять більше, — ураження відсутні.

СИРОВАТКА ПРОТИПРАВЦЕВА

Immunosenim tetanicum ad usum humanum

TETANUSANTITOXIN FOR HUMAN USE

ВИЗНАЧЕННЯ

Сироватка протиправцева (правцевий антитоксин) — препарат, що містить сироваткові глобуліни, здатні специфічно нейтралізувати токсин, утворений Clostridium tetani.

ВИРОБНИЦТВО

Одержують фракціонуванням сироватки коней або інших ссавців, імунізованих проти правцевого токсину.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Специфічно нейтралізує утворений С/. геми/токсин, знешкоджуючи його для сприйнятливих до нього тварин.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Не менше 1000 МО протиправцевої сироватки на мілілітр для профілактичного застосування і не менше 3000 МО протиправцевої сироватки на мілілітр для терапевтичного застосування.

Активність протиправцевої сироватки визначають шляхом порівняння дози, необхідної для захисту мурчаків або мишей від паралітичних ефектів, викликаних фіксованою дозою правцевого токсину, з кількістю стандартного препарату протиправцевої сироватки, необхідної для отримання такого самого захисту. В країнах, де метод паралічу не обов'язковий, можна використовувати метод летальних ефектів. Для цього методу кількість тварин і методика аналогічні описаному методу паралітичного ефекту, але кінцевою точкою вважають смерть тварин, а не параліч, і використовують L+/10 дозу замість Lp/10 дози. Для цього порівняння потрібен стандартний препарат протиправцевої сироватки, калібрований у Міжнародних одиницях (МО), і підхожий для використання як тест-токсин препарат правцевого токсину. Активність тест-токсину визначають відносно стандартного препарату, активність випробовуваної протиправцевої сироватки визначають тим самим методом відносно активності тест-токсину.

Міжнародна одиниця протиправцевої сироват- ки—це специфічна активність нейтралізації правцевого токсину, яка міститься в зазначеній кількості міжнародного стандартного препарату, що складається з певної кількості висушеної імуносироватки коня. Еквівалент МО міжнародного стандартного препарату встановлює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

Вибір випробовуваних тварин. При використанні мишей різниця в масі тіла між найважчою і найлегшою твариною не має перевищувати 5 г.

Приготування тест-токсину. Тест-токсин готують зі стерильного фільтрату культури CI. tetani. яка культивувалася в рідкому середовищі близько 9 діб. До фільтрату додають 1:2 об'єму гліцерину і зберігають при температурі дещо нижче 0 °С. Альтернативно фільтрат обробляють амонію сульфатом Р. відбирають осад, що містить токсин, висушують у вакуумі над фосфору (V) оксидом Р. розтирають у порошок і зберігають у сухому вигляді в запаяних ампулах або під вакуумом над фосфору (V) оксидом Р.

Визначення тест-дози токсину (Lp/ІОдоза). У підхожій рідині готують розчин стандартного препарату7, що містить 0.5 МО протиправцевої сироватки на мілілітр.

Якщо тест-токсин зберігають у сухому вигляді, то його розчиняють у підхожій рідині.

Готують суміші розчинів стандартного препарату й розчину тест-токсину: кожна містить по 2.0 мл розчину стандартного препарату, один із розташованих послідовно об'ємів тест-токсину. і доводять загальний об'єм підхожою рідиною до 5.0 мл. Суміші ви-

гримують при кімнатній температурі в захищеному віл світла місці протягом 60 хв. Для кожної суміші використовують по шість мишей. Підшкірно кожній миші вводять по 0.5 мл суміші. За мишами спостерігають протягом 96 год. Паралізованих мишей присипляють.

Тест-доза токсину — це його мінімальна кількість у 0.5 мл суміші, частково нейтралізована стандартним препаратом, здатна викликати параліч у всіх шести мишей у період спостереження.

Визначення активності протиправцевої сироватки.

Готують розчин стандартного препарату у підхожій рідині, що містить 0.5 МО протиправцевої сироватки на мілілітр.

Готують розчин тест-токсину в підхожій рідині, що містить 5 тест-доз на мілілітр.

Готують суміші розчинів тест-токсину і випробовуваної протиправцевої сироватки: кожна містить по 2.0 мл розчину тест-токсину, один із розташованих послідовно об'ємів випробовуваної протиправцевої сироватки, і доводять загальний об'єм підхожою

Сироватка протиправцева

рідиною до 5.0 мл. Також готують суміш) роїчишв тест-токсину і розчину стандартного препарату, що містять 2.0 мл розчину тест-токсииу, один із розташованих послідовно об'ємів розчину стандартного препарату, центрованих за об'ємом 2.0 мл, шо містить 1 МО, і доводять загальний об'єм підхожою рідиною до 5.0 мл. Суміші витримують при кімнатній температурі в захищеному від світла місці протягом 60 хв. Підшкірно кожній миші вводять по0.5 мл суміші. За мишами спостерігають протягом 96 год. Паралізованих мишей присипляють.

Суміш, що містить найбільший об'єм протиправцевої сироватки, який не здатний захистити мишей від паралічу, містить І МО. Цю кількість використовують для розрахунку активності протиправцевої сироватки у Міжнародних одиницях на мілілітр.

Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо всі миші, яким вводили суміші, що містять 2.0 мл або менше розчину стандартного препарату, паралізовані, а ті, яким вводили суміші, що містять більше, — ні.

клітини. Епідерма зав'язі вкрита: ефіроолійними залозками із короткими ніжками та багатоклітинними кулястими голівками; здвоєними покривними волосками, шо, звичайно, складаються із 2 подовжньо з'єднаних клітин із дрібно крапчастими оболонками; їх кінці гострі та, звичайно, роздвоєні. Епідерма чашечки складається із видовжених клітин, вкритих короткими, одноклітинними покривними волосками, шо на верхівці закінчуються щетинкою. Пилкові зерна близько ЗО мкм удіаметрі, округлі, із шипуватою екзиною та 3 проростковими порами.

ЗОмш

Рисунок 1391.-2. Діагностичні структури арніки квіток (Ідентифікація В)

A.Епідерма приквітків обгортки із покривними волосками та продиховими апаратами

B.Багатоклітинна ніжка покривного волоска

C.Пилкові зерна

D.Епідерма приквітків обгортки із продиховими апаратами та ефіроолійними залозками

E.Ефіроолійна залозка

С.Переглядають хроматограму, одержану у випробуванні Calendula officinalis L. — Heteroiheca inuloides Cass.

Результати: на хроматограмі випробуваного розчину мають виявлятися: у середній частині - флуоресціююча блакитна зона, відповідна зоні кислоти хлорогенової на хроматорамі розчину порівняння; над цією зоною - 3 флуоресціюючі жовтаво-коричневі або оранжево-жовті зони; над цими 3 зонами - зеленувато-жовта зона, відповідна астрагаліну; зона, розташована нижче зони астрагаліну, відпо-

відна ізокверцетрозиду; зона, розташована нижче цієї зони, відповідналютеолін-7-глюкозиду. Також має виявлятися зеленувато-блакитна зона нижче зони кислоти кофейної на хроматограмі розчину порівняння.

ВИПРОБУВАННЯ

Сторонні домішки (2.8.2). Не більше 5.0 %.

Calendula officinalis L. - Heteroiheca inuloides Cass. Тонкошарова хроматографія (2.2.27).

Випробовуваний розчин. До 2.00 г здрібненої на порошок сировини (710) (2.9.12) додають 10 мл метанолу Р, нагрівають, струшуючи, у водяній бані при температурі 60 °С протягом 5 хв, охолоджують і фільтрують.

Розчин порівняння. 2.0 мг кислоти кофейної Р, 2.0 мг кислоти хлорогенової Р і 5.0 мг рутину Р розчиняють у метанолі Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до ЗО мл.

Пластинка: ТШХпластинка із шаром силікагелю Р.

Рухома фаза: кислота мурашина безводна Р - вода Р - метшетилкетон Р - етилацетат Р (10:10:30:50).

Об'єм проби, що наноситься: 15 мкл, смугами.

Відстань, що має пройти рухома фаза: 15 см від лінії старту.

Висушування: на повітрі протягом кількох хвилин.

Виявлення: обприскують розчином 10 г/л аміноетилового ефіру дифеніаборної кислоти Р у метанолі Р, потім розчином 50 г/л макроголу 400Ру метанолі Р,

нагрівають при температурі від 100 °С до 105 °С протягом 5 хв, охолоджують на повітрі та переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

Результати: на хроматограмі розчину порівняння мають виявлятися: у нижній частині - оранжевожовта флуоресціююча зона, відповідна рутину; у середній частині — флуоресціююча зона, відповідна кислоті хлорогеновій; у верхній частині — світлоблакитнувата флуоресціююча зона, відповідна кислоті кофейній. На хроматограмі випробовуваного розчину не має виявлятися флуоресціююча оранжево-жовта зона, відповідна зоні рутину на хроматограмі розчину порівняння, не має виявлятися зона нижче цієї зони.

Втрата в масі при висушуванні (2.2.32). Не більше 10.0 %. 1.000 г здрібненої на порошок сировини (355) (2.9.12) сушать при температурі 105 °С протягом 2 год.

Загальна зола (2.4.16). Не більше 10.0 %.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Рідинна хроматографія (2.2.29)