Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

Таблица 5.3.1.-1.

Исходные данные для количественного определения

Теперь натуральный логарифм отношения активностей может быть рассчитан,

как описано в Разделе 4.2.3.

Натуральный логарифм доверительного интервала:

0,155 − 0,013 ± 0,127(0,649 + 1,127 × 0,0362 ) = 0,142 ± 0,288

Вычислив антилогарифм и умножив полученное значение на предполагаемую активность 40 МЕ/флакон, получим оценку активности 160,6 МЕ/флакон и 95% довери-

тельный интервал от 121,0 до 215,2 МЕ/флакон.

Таблица 5.3.1.-2.

Первая рабочая таблица для первого цикла итерации

Таблица 5.3.1.-3.

Вторая рабочая таблица для первого цикла итерации

Рисунок 5.3.1.-1.

5.3.2ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛОГИТ-АНАЛИЗА И ДРУГИХ АНАЛОГИЧНЫХ МЕ-

ТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИ СРАВНЕНИИ ИСПЫТУЕМОГО ПРЕПАРАТА СО СТАНДАРТНЫМ ПРЕПАРАТОМ

Результаты будут описаны для случая, в котором метод логит-анализа и другие

«классические» методы данного типа используют данные, предоставленные в Разделе 5.3.1. В данной конкретной ситуации приведенный материал следует рассматривать как упражнения, а не в качестве альтернативного методу пробит-анализа. Другая форма кривой может быть принята только в том случае, если необходимость замены под-

тверждается экспериментальными данными или теоретическими расчетами.

Таблица 5.3.2.-1.

Результаты, полученные при использовании альтернативных методов анализа

5.3.3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭД50 ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЯ МЕТОД ПРОБИТ-АНАЛИЗА

Количественное определение in vivo вакцины против полиомиелита, применяемой

орально

Для количественного определения ЕД50 вакцины против полиомиелита было ис-

следовано 10 различных разведений 50 мкл исходной вакцины на чашках Элиса по 8

повторений в каждом случае. Полученные результаты приведены в Таблице 5.3.3.-1.

Таблица 5.3.3.-1.

Разведения (10× мкл исходной вакцины)

Полученные результаты заносят в первую рабочую таблицу, а остальные ее столбцы заполняют как описано в Разделе 4.2.1. В Таблице 5.3.3.-2 приведены резуль-

таты первого цикла процедуры итерации, описанной в данном разделе.

Таблица 5.3.3.-2.

Первая рабочая таблица для первого цикла

Затем данные оставшихся шести столбцов суммируют для каждого из препара-

тов и результаты заносят во вторую рабочую таблицу (см. Таблицу 5.3.3.-3). Остальные столбцы заполняют данными, рассчитанными по формулам 4.2.1.-4 – 4.2.1.-10. В

результате получают общий угловой коэффициент b, равный –0,295.

Далее значения Y первой рабочей таблицы заменяют на значения a+bx и выполняют второй цикл итерации. Циклы повторяют до тех пор, пока разница между результатами двух последовательных циклов не станет достаточно маленькой. В резуль-

тате получают вторую рабочую Таблицу 5.3.3.-4.

Таблица 5.3.3.-4.

Вторая рабочая таблица после проведения достаточного числа циклов

Проверку линейности проводят как описано в Разделе 4.2.2. Значение χ2 для 8

степеней свободы равно 2.711, чему соответствует значение p=0,951, которое не является статистически значимым.

Теперь оценка отношения активностей может быть получена, как описано в Раз-

деле 4.5.

MT' = − (−7,931) = −12,273

− 0,646

Далее

Натуральный логарифм доверительного интервала

-14,692 - (-2,420 ) ± 0,197 ´(2,882 +1,197 ´ 0,0092 = -12,272 ± 0,754

Эта оценка все еще выражена в виде натурального логарифма разведений. Для того, чтобы выразить активность в ln(ЕД50)/мл, результаты преобразуют в

Поскольку активность такого типа вакцин обычно выражают с использованием десятичного логарифма log10(ЕД50)/мл, полученный результат следует разделить на ln(10). В результате получим оценку активности 6.36 log10(ЕД50)/мл при 95% довери-

тельном интервале 6.30-6.96log10(ЕД50)/мл.

Рисунок 5.3.3.-1.

6 ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

6.1.ВВЕДЕНИЕ

Сцелью удовлетворения требованиям Фармакопеи, часто необходимо повторение независимых количественных определений и объединение полученных результа-

тов. В связи с этим возникает вопрос, в каких случаях возможно объединение результатов и каким образом это осуществляется.

Два количественных определения могут быть рассмотрены как действительно независимые, если выполнение любого из них не влияет на вероятности появления

возможных результатов другого. Это означает, что случайные ошибки всех существен-

ных факторов, которые могут повлиять на результат в ходе выполнения одного количественного определения (например, разведения стандартного и испытуемого препара-

тов, чувствительность биологических индикаторов), не зависят от соответствующих случайных ошибок этих факторов в ходе выполнения другого количественного опреде-

ления. Таким образом, количественные определения, которые проводятся в последующие дни с использованием одинаковых сохраненных разведений стандартного препарата не являются независимыми.

Существует несколько методов объединения результатов независимых количе-

ственных определений, наиболее приемлемый из них с теоретической точки зрения является довольно сложным при практическом использовании. Ниже описаны три про-

стых метода аппроксимации; однако могут использоваться и другие методы, если выполнены необходимые условия объединения результатов.

Если данные количественного определения основываются на использовании модели параллельных линий или модели пробит-анализа, полученные значения активно-

стей перед объединением необходимо представить в логарифмическом виде; значения активностей, полученные при использовании модели угловых коэффициентов, объединяют без преобразований. Поскольку модель параллельных линий используют чаще, чем модель угловых коэффициентов, в данном разделе в формулах используется символ М, обозначающий натуральный логарифм отношения активностей. Подстав-

ляя вместо М отношения угловых коэффициентов R, можно применять те же формулы для определения активностей, найденных при использовании модели угловых коэф-

фициентов. Перед объединением оценки активностей всех исследованных препаратов

должны быть скорректированы по отношению к установленной активности.

6.2. ВЗВЕШЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Данный метод может быть использован только в том случае, если выполняются следующие условия:

1)оценки активностей получены в ходе независимых количественных определе-

ний;

2)для каждого из количественных определений значение С близко к 1 (другими словами, меньше чем 1.1);

3)число степеней свободы конкретных неисключенных погрешностей не меньше 6,

но желательно, чтобы оно было больше 15;

4)оценки конкретных активностей образуют однородное множество (см. Раздел

6.2.2).

Если эти условия не выполняются, метод нельзя использовать. В этом случае для

нахождения наилучшей оценки средней активности, которая затем будет применяться в последующих количественных определениях в качестве предполагаемой активности,

может использоваться метод, описанный в Разделе 6.3.

6.2.1. РАСЧЕТ ВЕСОВЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ

Предположим, что проведено n’ количественных определений, в ходе которых получено n’ значений М с соответствующими доверительными интервалами. Для каждого

количественного определения рассчитывается логарифмический доверительный ин-

тервал L путем вычитания нижнего значения от верхнего. Вес W для каждого значения М вычисляется по формуле 6.2.1.-1, где t имеет то же значение, которое используется

при расчете доверительных интервалов.

6.2.2. ОДНОРОДНОСТЬ ОЦЕНОК АКТИВНОСТИ

Однородность оценок активностей определяют следующим образом. Отклонение каждого из значений М от взвешенного среднего возводят в квадрат, умножают на со-

ответствующий вес и суммируют по всем количественным определениям. В результате

получают статистику, приблизительно распределенную как χ2, и которая может исполь-

зоваться для оценки однородности множества натуральных логарифмов оценок активностей:

Если рассчитанное значение χ2 меньше табличного значения, соответствующего (n’-1) степеням свободы, то активности однородны, и среднее значение активности, а также доверительные интервалы, рассчитанные при помощи метода, описанного в

Разделе 6.2.3 будут обоснованными.

Если рассчитанное значение статистики больше табличного, активности неоднородны. Это означает, что отклонение между конкретными оценками М больше,

чем можно было бы ожидать, исходя из оценок доверительных интервалов. То есть

между количественными определениями существует значительная вариабельность. В этом случае условие 4 не выполняется и формулы, приведенные в Разделе 6.2.3 не применимы. Вместо них могут быть использованы формулы, приведенные в Разделе

6.2.4.

6.2.3. РАСЧЕТ ВЗВЕШЕННОГО СРЕДНЕГО И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНЫХ

ИНТЕРВАЛОВ

Для каждого количественного определения рассчитывают значения WM, а их

сумму делят суммарный вес всех количественных определений. В результате получа-

ют значение логарифма взвешенной средней активности

стандартная ошибка натурального логарифма средней активности вычисляется как

квадратный корень из величины, обратной суммарному весу:

а приблизительный доверительный интервал равен антилогарифму значения

где число степеней свободы t равно сумме чисел степеней свободы средних квадратов

ошибок отдельных количественных определений.

6.2.4. ВЗВЕШЕННОЕ СРЕДНЕЕ И ДОВЕРИТЕЛЬНЫЕ ИНТЕРВАЛЫ ОТКЛОНЕНИЯ В

ПРЕДЕЛАХ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕЖДУ НИМИ.

При объединении результатов нескольких повторных количественных определе-

ний, величина χ2 может быть значимой. В этом случае полученная вариация имеет два компонента:

- вариация в пределах серии количественных определений sM2 = 1 / W

- вариация между сериями количественных определений

M – невзвешенное среднее значение.

Первый компонент изменяется от одного количественного определения до другого, то-

гда как второй компонент является общим для всех М.

Тогда для каждого значения М рассчитывают весовой коэффициент

который заменяет значение W в Разделе 6.2.3; t прибизительно равно 2.

6.3. НЕВЗВЕШЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Наиболее простым способом объединения n’ оценок для значений М при n’ коичественных определениях, является вычисление среднего значения и оценка стандартного отклонения по формуле

где t имеет (n’-1) степеней свободы. Число n’ оценок значений М обычно мало, а

значение t, соответсвенно, довольно велико.

6.4. ПРИМЕР ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЗЕШЕННОЙ СРЕДНЕЙ АКТИВНОСТИ С ДОВЕРИТЕЛЬНІМ ИНТЕРВАЛОМ

В таблице 6.4.-1 приведено шесть независимых оценок активности одного и того же препарата, а также их доверительные интервалы и число степеней свободы для их

дисперсий ошибки. Условия 1,2 и 3, приведенные в Разделе 6.2., выполнены. Натуральный логарифм активностей и веса рассчитаны, как описано в Разделе 6.2.

Таблица 6.4.-1.

Оценки активностей и доверительные интервалы шесит независимых количественных определений

Однородность оценок активностей рассчитывают по формуле 6.2.2.-1, в результате получают значение χ2, равное 4,42 при 5 степенях свободы. Этот результат не является статистически значимым (р=0,49) и, следовательно, все условия для при-

менения оценки взвешенной средней активности выполняются.

Взвешенную среднюю активность вычисляют по формуле 6.2.3.-2, в результате получают значение 9,8085.

По формуле 6.2.3.-2 рассчитывают стандартное отклонение, равное 0,00673, а по формуле 6.2.3.-3 вычисляют 95% доверительный интервал 9,7951 – 9,8218, где t имеет 120 степеней свободы.

Взяв антилогарифм, получают значение активности, равное 18187 МЕ/флакон при

95% доверительном интервале от 17946 до 18431 МЕ/флакон.

7. ДОПОЛНЕНИЕ

Невозможно дать исчерпывающий обзор статистических методов, используемых при проведении фармакопейных исследований. Тем не менее методы, изложенные в

данной статье, удовлетворяют требованиям большинства фармакопейных целей. В

данном разделе сделана попытка представить более абстрактный обзор альтернативных или наиболее общих методов статистического анализа. Заинтересованные лица

могут также обратиться к специальной литературе по этой теме. В случае использова-

ния более специализированных методов статистического анализа, следует обратиться за помощью к квалифицированным специалистам.

7.1. ОБЩИЕ ЛИНЕЙНЫЕ МОДЕЛИ

Методы, изложенные в данной статье, могут быть описаны в рамках общих линейных моделей (или обобщенных линейных моделей для того, чтобы включить мето-

ды пробит и логит-анализа). Принцип основан на построении линейной матрицы структуры Х (или матрицы планирования), в которой каждая строка представляет результа-

ты наблюдения, а каждый столбец – один из линейных факторов (препарат, блок, столбец, дозу). Например, в случае схемы латинского квадрата, рассмотренной в Раз-

деле 5.1.2, такая матрица состояла бы из 36 строк и 13 столбцов. По одному столбцу на каждый из препаратов, один столбец для доз, пять столбцов на каждый из блоков, за исключением первого, и пять столбцов для каждой строки, за исключением первой. Все столбцы, за исключением одного для доз, заполняют 0 или 1 в зависимости от того, связано данное наблюдение с данным фактором или нет. Вектор Y заполняют результатами наблюдений (преобразованными). Искомые параметры вычисляют по формуле (XtX)-1XtY, после чего оценка активности m может быть легко получена как от-

ношение соответствующих параметров. Доверительные интервалы рассчитываются на

основе теоремы Филлера (Fieller):

где :

g = t 2s2vu22 b2

а v11, v22 – множители дисперсии знаменателя и числителя, соответственно; v12 – мно-

житель ковариации. Эти множители можно непосредственно вычислить из матрицы (XtX)-1, или косвенным методом, приняв во внимание, что Var(a1-a2)=Var(a1)+Var(a2)- 2Cov(a1,a2), а Cov(a1-a2,b)=Cov(a1,b)-Cov(a2,b).

Полный дисперсионный анализ с полным разделением компонентов более сложен, поскольку он предполагает пересмотр матрицы X, к которой при этом дополняют-

ся столбцы для ослабления предположений о параллельности и линейности, после чего может быть проверена гипотеза о линейности. В случае количественных определений, зависящих от альтернативных эффектов, факторы линейности (точки пересечения с осью ординат aS, aT и т.д. общий угловой коэффициент b) находят путем максимиза-

ции суммы по группам препаратов nlnΦ(ai+bx)+(n-r)ln(1-Ф(ai+bx)), где x – натуральный

логарифм дозы (ln(доза)), Φ – определяет форму распределения, i Î{S,T,…}.

7.2. НЕОДНОРОДНОСТЬ ДИСПЕРСИИ

Проблема неоднородности дисперсии не всегда может быть решена путем простого преобразования результатов. В этом случае один из возможных способов решения данной проблемы состоит в применении метода взвешенной линейной регрессии. Чтобы получить объективную оценку, веса результатов наблюдений берутся как вели-

чины обратно пропорциональные дисперсии ошибок. Так как истинное значение дис-

персии ошибок не всегда известно, веса могут подбираться с использованием линейной итеративной процедуры. Однако при расчете доверительных интервалов при этом возникают дополнительные проблемы.

7.3. ВЫБРОСЫ И УСТОЙЧИВОСТЬ МЕТОДОВ В РАБОТЕ (РОБАСТНОСТЬ)

Недостатком метода наименьших квадратов, описанного в данном приложении, является его довольно высокая чувствительность к резко отклоняющимся от среднего

данным. Очевидный выброс может целиком исказить результаты вычислений. Эту про-

блему часто решают путем исключения выбросов из набора данных. Такой подход может привести к субъективному исключению данных – не всегда корректному и безопас-

ному. Довольно сложно дать общие рекомендации, касающиеся решения относительно того является ли конкретный результат наблюдения выбросом или нет, и с этим связа-

но появление и развитие ряда робастных (устойчивых в работе) методов анализа. Эти методы менее чувствительны к выбросам, за счет того, что результатам, которые в

большей мере отличаются от прогнозируемого значения, придается меньший вес. В данном случае возникает ряд новых проблем, связанных с расчетом доверительных интервалов, а так же с определением подходящей функции для минимизации ошибок.