Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

3.3.3 ДИСПЕРСИОННЫЙ АНАЛИЗ

3.3.3.1 (hd+1)-схема

Результаты проверяют согласно требованиям, описанным в Разделе 3.1 и, если

необходимо, проводят их преобразование. Затем для каждого эксперимента и каждого препарата вычисляют среднее значение, как описано в Таблице 3.3.3.1-I. Дополнительно рассчитывают среднее значение для плацебо исследований (В).

В Таблицах 3.3.3.1.-1 – 3.3.3.1.-3 приведен расчет суммы квадратов для дисперсионного анализа. Сумма квадратов, обусловленная нелинейностью, может быть рас-

считана только в том случае, если в план количественного определения было включено, по крайней мере, по три дозы каждого из препаратов. Неисключенную (остаточную)

погрешность находят путем вычитания вариации, предусмотренной планом эксперимента, из общей вариации для результата исследования (Таблица 3.3.3.1.-IV).

Далее дисперсионный анализ завершают следующим образом: каждую сумму квадратов отклонений делят на соответствующее число степеней свободы для вычисления дисперсии (среднего квадрата отклонений). Затем оценивают значимость отношения дисперсии (среднего квадрата отклонений) для каждой переменной к неисклю-

ченной (остаточной) погрешности (s2) (F-отношение). Для этого можно воспользоваться Таблицей 8.1 или соответствующей подпрограммой компьютерного программного

обеспечения.

Таблица 3.3.3.1.-1.

Формулы для d-дозовых количественных определений с использованием модели угловых коэффициентов для каждого препарата и плацебо испытания.

Таблица 3.3.3.1.-2.

Дополнительные формулы для проведения дисперсионного анализа

3.3.3.2 (hd)-схема

Для этой схемы используются, в основном, те же самые формулы, что и для

(hd+1)-схемы, за исключением некоторых небольших различий:

-переменная В исключается из всех формул.

- Значение К рассчитывается как K = n(PS + PT + ...)2 hd

-SSblank исключается из дисперсионного анализа.

-Число степеней свободы для вариаций, обусловленных группами равно hd-1.

-Число степеней свободы для неисключенной (остаточной) погрешности и общей

вариации рассчитывают, как описано для модели параллельных линий (см. Таб-

лицу 3.2.3.-IV).

Обоснованность (достоверность) количественного определения, активность и границы доверительного интервала определяют, как описано в Разделах 3.3.4 и 3.3.5.

3.3.4 ИССЛЕДОВАНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ

Результаты количественного определения считаются «статистически значимыми», если результаты, полученные при дисперсионном анализе, удовлетворяют сле-

дующим условиям:

1)Вариация, обусловленная плацебо в (hd+1)-схеме, не является статистически зна-

чимой, т.е. рассчитанная вероятность ≥0.05. Это означает, что результаты, полученные при плацебо исследовании, не существенно отличаются от общей точки

пересечения и линейная зависимость сохраняется вплоть до нулевой дозы.

2)Вариация, связанная с точкой пересечения, не является значимой, т.е. рассчитанная

вероятность ≥0.05. Это означает, что выполняется условие 5В, Раздел 3.1.

3)В количественном определении, которое включает, по крайней мере, по три дозы для каждого из препаратов, вариация, обусловленная нелинейностью, не является

значимой, т.е. рассчитанная вероятность ≥0.05. Это означает, что выполняется ус-

ловие 4В, Раздел 3.1.

Статистически значимая вариация, обусловленная проведением плацебо исследования, свидетельствует о том, что предположение о линейности не подтверждается для диапазона доз возле нулевой точки. Если это отклонение носит скорее систематический, чем случайный характер, наиболее подходящей является (hd)-схема. При этом

любые результаты, связанные с плацебо исследованиями, должны быть исключены.

Если все выполненные исследования свидетельствуют о достоверности (обос-

нованности) количественного определения, активность и границы доверительного ин-

тервала рассчитываются, как описано в Разделе 3.3.5.

3.3.5 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНОГО ИНТЕРВАЛА

3.3.5.1 (hd+1)-схема

Общая точка пересечения а’ для препаратов может быть вычислена по форму-

угловой коэффициент для стандартного препарата и, аналогично, для каждого из дру-

гих препаратов, рассчитывают по формуле:

Отношение активностей для каждого из препаратов, теперь может быть рассчи-

тано следующим образом:

Для определения рассчитанной активности RT, полученное значение нужно

умножить на предполагаемую активность АТ испытуемого препарата. Если интервал между дозами стандартного и испытуемого препаратов не был одинаковым, активность

следует умножить на величину IS/IT. Обратите внимание, что в отличие от модели параллельных линий, антилогарифмы при этом не вычисляются.

Доверительный интервал для переменной RT' вычисляется по формуле:

Доверительный интервал умножается на величину АТ и, если необходимо, на величину IS/IT.

3.3.5.2 (hd)-схема

Для этой схемы используются те же формулы, что и для (hd+1)-схемы за исклю-

4. ТЕСТЫ С АЛЬТЕРНАТИВНЫМ ТИПОМ ЭФФЕКТА

4.1.ВВЕДЕНИЕ

Вряде случаев невозможно или слишком трудоемко количественно оценить

эффект для каждого экспериментального объекта. В то же время, такие результаты, как смерть или симптомы гипогликемии, могут либо наступить, либо не возникать у ка-

ждого из экспериментальных объектов, и общий итог будет зависеть от количества

объектов, для которых такой результат наступил. Такой тип исследования называется количественным определением с альтернативными (дискретными) результатами или

количественным определением типа «все или ничего».

Ситуация при этом в целом очень похожа на описанную в Разделе 3.1, но вместо n различных результатов для каждой группы, записывают одно значение, т.е. процент объектов в каждой испытуемой группе, у которых проявился эффект. Если эти результаты представить в виде графика зависимости доли прореагировавших объектов от ло-

гарифма дозы, получим не линейную, а сигмоидную кривую (s-образной формы). Для анализа сигмоидной кривой «доза-эффект» применяют математическую функцию, опи-

сывающую данную кривую. Обычно используют кумулятивную функцию нормального распределения (характеристическую кривую). Эта функция имеет преимущества с тео-

ретической точки зрения и, очевидно, является предпочтительной, если результат отражает толерантность экспериментальных объектов. Если результаты связаны с про-

цессами роста, предпочтительной является логистическая функция распределения, хотя различие в результатах, полученных при использовании этих двух функций, как правило, незначительно.

Максимальная достоверность оценки угловых коэффициентов и расположения

кривых может быть достигнута только при использовании итерационных процедур. Существует множество таких процедур, которые приводят к одинаковым результатам,

но отличаются по эффективности вследствие разной скорости конвергенции. Одним из

наиболее быстрых методов является метод прямой оптимизации функции максимальной правдоподобности (см. Раздел 7.1). Этот метод можно легко реализовать при помощи компьютерного программного обеспечения, имеющего соответствующую встроенную подпрограмму.

К сожалению, большинство этих процедур не дают оценки границ доверительно-

го интервала, а методики их вычисления слишком сложны для рассмотрения в данном

разделе. Методика, приведенная ниже, не является самой быстрой, но достаточно проста по сравнению с другими методиками. Эта методика может применяться для ко-

личественных определений, в которых дин или более испытуемых препаратов сравни-

ваются со стандартным препаратом. Кроме этого, должны выполняться следующие условия:

1)Зависимость между логарифмом дозы и полученным результатом должна быть представлена в виде кумулятивной кривой нормального распределения (характеристическая кривая);

2)Кривые для стандартного и испытуемого препаратов должны быть параллельны, т.е. иметь одинаковую форму, и могут различаться только расположением по оси

абсцисс;

3)Теоретически, не должно наблюдаться эффекта от введения чрезвычайно малой

дозы, и невозможно отсутствие эффекта от введения чрезвычайно большой дозы.

4.2.МЕТОД ПРОБИТ-АНАЛИЗА

Сигмоидную кривую можно преобразовать в прямую линию путем замены каждого эффекта (т.е. доли объектов у которых появился эффект) в группе соответствующи-

ми значениями нормального эквивалентного отклонения от среднего эффекта. Эти

значения, часто называемые «нормиты»4, теоретически находятся в интервале от +∞ до -∞. Ранее было принято к каждому «нормиту» прибавлять число 5, таким образом,

получали так называемые «пробиты»5. Это облегчало проведение расчетов вручную, потому что в этом случае исключались отрицательные результаты. С появлением ком-

пьютеров необходимость в прибавлении 5 отпала. Поэтому метод, описываемый ниже, правильнее было бы назвать «метод нормит-анализа». Однако, поскольку термин «метод пробит-анализа» широко распространен и используется в литературе, он сохраняется в данной статье исходя из исторических соображений.

На первый взгляд кажется, что после линеаризации результатов следует приме-

нять метод параллельных линий, описанный в Разделе 3.2. Однако, это не так, поскольку для каждой дозы не выполняется условие однородности дисперсий. Дисперсия

минимальна, если нормит равен нулю и возрастает, как для позитивных, так и для негативных значений нормита. Следовательно, необходимо придать больший вес значе-

ниям в средней части кривой, и меньший ее крайним частям. Ниже приведено описание такого метода, а также процедура дисперсионного анализа, оценка активности и границ доверительного интервала.

4.2.1ПОДГОТОВКА РАБОЧИХ ТАБЛИЦ РЕЗУЛЬТАТОВ

Втаблицу 4.2.1.-1 заносятся данные по столбцам, номера которых обозначают

следующее:

(1) Доза (D) стандартного или испытуемого препарата;

(2) Число n объектов, подвергшихся исследованию;

(3) Число r объектов у которых получен позитивный эффект в ходе исследования;

(4) Логарифм х дозы;

(5) Доля позитивных эффектов p=r/n в группе; Далее начинается первый цикл

(6) Столбец Y при первой итерации заполняют нулями;

(7) Соответствующие значения Ф=Ф(Y) функции кумулятивного стандартного (характеристической кривой) распределения (см. также Таблицу 8.4);

Значения, заносимые в столбцы (8)-(10) вычисляют по формулам:

легко вычислить при помощи данных, находящихся в столбцах (4), (9) и (10), затем вы-

числяют сумму (Σ)этих значений для каждого из препаратов.

4от англ. «normality unit»

5от англ. «probability unit»

Значения, приведенные в столбце (6) первой рабочей таблицы, теперь заменяют на значения Y=a+bx, и повторяют цикл вычислений до тех пор, пока разница между

двумя последовательными циклами не станет достаточной маленькой (например, максимальная разница Y между двумя соседними циклами будет меньше 10-8).

4.2.2 ИССЛЕДОВАНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ

Перед тем, как начать вычисление активностей и границ доверительных интервалов следует оценить достоверность (обоснованность) количественного определения. Если для каждого из препаратов было проведено по три исследования, то отклонение

от линейности может быть рассчитано следующим образом: к Таблице 4.2.1.-2 добавляют тринадцатый столбец и заполняют значениями

S2

Syy = Sxy (4.2.2.-1) xx

Суммарное значение данных этого столбца является мерой отклонения от линейности и приблизительно подчиняется χ2-распределению со степенями свободы

равными N-2h. Значимость этой величины можно оценить при помощи Таблицы 8.3 или соответствующей подпрограммы компьютерног программного обеспечения. Если при уровне вероятности 0,05 рассчитанная величина является значимой, количественное определение следует отклонить (см. Раздел 4.2.4).

Если не выявлено зачимого отклонения от линейной регрессии, проверяют отклонение

от паралельности при уровне значимости 0,05, для чего рассчитывают значение при числе степеней свободы, равном h-1.

4.2.3 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНОГО ИНТЕРВАЛА

Если нет никаких признаков значительного отклонения от линейности и парал-

лельности, вычисляют натуральный логарифм отношения активностей MT' по формуле:

Вычисляют антилогарифм этого значения. Далее приняв значения t=1,96 и s=1, рас-

считывают границы доверительного интервала как антилогарифм значения:

V = å1ω + å1ω

ST

4.2.4НЕДЕЙСТВИТЕЛЬНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если отклонения от линейности, описанные в Разделе 4.2.2, являются статисти-

чески значимыми, результаты количественного определения обычно признают несостоятельными. Если существуют основания для сохранения количественного опреде-

ления, формулы существенно изменяются. Величину t берут равной t-значению (р=0.05) с тем же числом степеней свободы, которое использовалось при проверке линейности. Значение s2 берут равным значению χ2, деленному на то же число степеней свободы (обычно это значение больше 1).

Испытание на параллельность также несколько видоизменяется. Значение χ2 для непараллельности делят на соответствующее число степеней свободы. Получен-

ное значение делится на рассчитанное выше значение s2, для определения F- отношения с h-1 и N-2h степенями свободы, которое оценивают обычным способом при

уровне значимости 0,05.

4.3. МЕТОД ЛОГИТ-АНАЛИЗА

Как отмечалось в Разделе 4.1 в некоторых случаях метод логит-анализа является наиболее приемлемым. Название метода происходит от названия функции логит-

преобразования, которая является обратной функции логистического распределения. Процедура в этом случае аналогична той, которая описана для метода пробитанализа, за исключением того, что видоизменяются две формулы для расчета значе-

ний Ф и Z.

(1 + e−Y )2

4.4. ДРУГИЕ ФОРМЫ КРИВОЙ

Для анализа количественных результатов тестов, предусмотренных Фармакопеей, почти всегда приемлемыми являются методы пробит- и логит-анализа. Однако, если

форма кривой зависимости «ln(доза)–эффект» отличается от форм этих двух кривых,

следует взять другую зависимость – Φ. Z в этом случае берется как первая производная от Φ.

Например, если выявляется, что кривая несимметрична, приемлемым может быть распределение Гомпертца (Gompertz) (метод гомпит-анализа). В этом случае

Φ= 1 − e−eY , а Z = eY −eY .

4.5.МЕДИАННАЯ ЭФФЕКТИВНАЯ ДОЗА

Для некоторых типов количественных определений необходимо определить медианную эффективную дозу, т.е. дозу, позитивный эффект на которую дают 50% объ-

ектов (ЕД50). Для определения этой дозы можно применить метод пробит-анализа, но

поскольку при этом нет необходимости сравнивать эту дозу со стандартным препаратом, формулы несколько отличаются.

Примечание: стандартный препарат может эпизодически применяться при использовании данного метода с целью проверки достоверности количественного определения. Обычно результаты количественного определения считаются достоверными, если рассчитанное значение ЕД50 для стандартного препарата достаточно близко к

принятому значению ЕД50. Значение термина «достаточно близко» в данном контексте

зависит от требований, предъявляемых в конкретной монографии на лекарственный препарат.

Подготовка рабочих таблиц результатов, полученных для испытуемых препара-

тов, и, при необходимости, для стандартного, описана в Разделе 4.2.1. Проверка линейности описана в Разделе 4.2.2. Проверка параллельности для данного типа количественного определения не требуется. Значение ЕД50 для испытуемого препарата Т (и аналогично для других тестируемых образцов) рассчитывается, как описано в Разделе

T

а значение С остается без изменений.

5.ПРИМЕРЫ

Вданном разделе приведены примеры, иллюстрирующие применение вышеописанных формул. Примеры подбирались, главным образом, с целью проиллюстрировать статистические методы обработки результатов. Их выбор в каждом случае не означает преимущество того или иного метода количественного определения перед аль-

тернативными методами, которые допускаются конкретной частной статьей. Для того,

чтобы сделать примеры подходящими для проверки достоверности работы компьютерных программ, в них приводится большее количество десятичных знаков, чем это обычно необходимо на практике. Следует также отметить, что существуют и альтернативные эквивалентные методики расчетов. Результаты, полученные при использова-

нии этих методик, должны быть точно такими же, как и те, которые приводятся в дан-

ных примерах.

5.1. МОДЕЛЬ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ЛИНИЙ.

5.1.1ДВУХДОЗОВОЕ МНОГОКРАТНОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИС-

ПОЛЬЗОВАНИЕМ СХЕМЫ ПОЛНОЙ РАНДОМИЗАЦИИ.

Количественное определение активности кортикотропина путем подкожной инъекции у крыс.

Стандартный препарат вводили в дозах от 0,25 до 1,0 ЕД на 100 г массы тела. Предполагалось, что оба испытуемых препарата имели активность 1 ЕД/мг и вводи-

лись в тех же количествах, что и стандартный. Значения эффектов и средние значения приведены в Таблице 5.1.1.-1.

Таблица 5.1.1.-1.

Измеряемый эффект y – масса аскорбиновой кислоты (мг) на 100 г надпочечника.