Лабораторная работа № 4 Тема: Методы посева и культивирование продуцентов.

Цель работы: Дать студентам представление о способах культивирования продуцентов, как самостоятельного разряда микроорганизмов, Ознакомить студентов с поверхностными и глубинными способами посева микроорганизмов, аэробными и анаэробными методами культивирования. Научится проводить посев на плотные и жидкие питательные среды.

Задание:

1. Изучить технику посева на питательные среды.

2. Сделать посев и пересев на жидкие питательные среды.

3. Провести посев на плотные питательные среды

- на скошенный мясо-пептонный агар;

- уколом в столбик питательной среды;

- петлей на среду в чашку Петри;

- шпателем или тампоном на среду в чашку Петри;

- в толщу питательной среды.

4. Изучить образовавшиеся колонии. Определить морфологию микроорганизмов.

5. Приготовить мазки и окрасить по Граму.

6. Промикроскопировать полученные препараты.

7. Зарисовать увиденное в микроскопе в тетрадь.

8. Оформить отчеты и ответить на контрольные вопросы.

Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; насос Камовского, эксикатор, анаэростат, карандаши по стеклу.

Теоретическая часть.

Для выделения культуры микробов из исследуемого материала (молока, мяса, воды, почвы и т. д.) в лабора­торных условиях используют метод посева и пересева. Посевомназывается внесение части исследуемого материала в чистую, стерильную питательную среду,пересе­вом— перенос части выросшей на питательной средекультуры микробов на другую, свежую стерильную пи­тательную среду (рис. 1).

П о с е в на плотную питательную среду. Техника посева зависит от консистенции питательной среды, на которой желают вырастить культуру микробов. Посев производят с помощью бактериологический петли и иглы или пипетки Пастера.

Рис. 1. Пересев из одной пробирки в другую

С целью предупреждения загрязнения среды микрофлорой воздуха пробир­ки держат наклонно над пламенем горелки или спиртов­ки. Далее поступают следующим образом:

1) в левую руку берут пробирку с микробной культурой и пробирку со стерильной питательной средой и держат в наклонном положении между большим и указательным пальцем; в правой руке держат петледержатель в вертикальном положении над пламенем горелки, прокаливают петлю до появления красного цвета, затем наклоняют горизонтально и 2—3 раза быстро проводят через пламя петледержатель;

2) взяв мизинцем и безымянным пальцами правой руки наружный конец ватной пробки, вынимают около пламени пробку из пробирки, после чего обжигают края обеих пробирок. Следят за тем, чтобы пробки ни к чему не прикасались;

3) вводят петлю в пробирку с микробной культурой. Для охлаждения петли нужно сначала прикоснуться к поверхности агара, где нет культуры, после чего осторожно снимают небольшое количество культуры или каплю жидкости (если среда жидкая) и быстро переносят (не прикасаясь к стенкам пробирки!) во вторую про­бирку со стерильной питательной средой; петлю опускают до конденсационной воды, находящейся на дне пробироксо свежими средами, и делают посев культуры одним изтрех способов:

посев штрихом — проводят зигзагообразную линию, свободно скользя петлей по поверхности среды от одного края пробирки к другому;

посев чертой — проводят петлю по прямой линии посредине поверхности питательной среды;

посев сплошной — растирают материал непрерыв­ными круговыми движениями по всей поверхности пита­тельной среды;

4) вынимают петлю, обжигают края пробирок и внут­ренние концы пробок (если пробки загораются, дуть на них ни в коем случае нельзя); следует быстро ввести их в пробирки, наружный конец гасят рукой или пинцетом;

5) прокаливают петлю на пламени и ставят ее на место;

6)па пробирке карандашом или чернилами по стек­лу ставят дату посева, название культуры микроба.

В столбики МПЖ или МПА сеют уколом(рис. 2).С этой целью стерильной иглой с набранным на нее ма­териалом прокалывают столбик агара или желатин в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подхо­дила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки, иглу извлекают, обжигают на пламени спиртовки до красного каления (убивают оставшихся на петле микробов), после чего край пробирки еще раз об­жигают на огне, проводят через пламя пробку и закры­вают пробирку. Край пробирки во время посева держат, не отнимая, около огня, фиксируя левую руку в этом по­ложении упором о край стола. Бактериологическую пет­лю помещают вштатив, а пробирку, отметив на ней номер экспертизы, дату посева и место, откуда был взят материал, помещают в термостат.

Посев в жидкую среду.При посеве в жидкую питательную среду стерильную бактериологическую пет­лю с набранным на нее материалом вносят в пробирку с соблюдением всех предосторожностей, описанных выше. Материал тщательно растирают по стенке пробирки у верхнего края среды, все время смывая его средой. При посеве пастеровской (рис. 3) пипеткой поверхность обжигают на пламени спиртовки, охлаждают, отнеся в сторону от огня, затем обломав стерильным пинцетом запаянный конец, набирают в нее материал, быстровносят в пробирку и производят посев так же, какэто делают петлей, соблюдая правила стерильности.

Рис. 2 Посев уколом Рис. 3. Пользование пипеткой Пастера

После использования пипетки ее помещают в сосуд с дезинфи­цирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты или др.).

Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов на искусственных питательных сре­дах требуется поддерживать в среде анаэробные условия не только в момент посева, но и в период их роста.

Для создания анаэробных условий применяют физический, химический, биологический и комбинированный методы.

Физический метод.В жидких питательных средах (Китт- Тароцци) анаэробные условия создаются путем:

а) удаления поглощенного средой кислорода ки­пячением в течение 10—15 мин с последующим быстрым охлаждением под струей холодной воды, после чего тотчас же производят посев и помещают в термостат;

б) заливки поверхности жидкости слоем индифферентного масла (вазелинового, па­рафинового), прекращающим доступ в среду атмосфер­ного воздуха;

в) разливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;

Рис. 4. Культура анаэробов в чашках Петри, помещенных в эксикатор, соединенный с масляным насосом

г) добавления к жидким средам до их стери­лизации кусочков печени, мышц, картофеля, яичного белка, а, также углеводов (глюкозы и др.), расщепляе­мых анаэробами в процессе размножения.

Анаэробные условия создаются путем удаления воз­духа из анаэростатов или эксикаторов (рис. 4) или за­мене его каким-либо индифферентным газом (водоро­дом, углекислым газом, азотом). Снижения давления воздуха в эксикаторах и анаэростатах до 0,0001 МПа (1 мм рт. ст.) путем выкачивания его при помощи ва­куум-насоса под контролем ртутного манометра доста­точно для выращивания строгих анаэробов. На дно эксикатора для поглощения избытка влаги помещают 20—30 г сухой поваренной соли или 5—6 г хлористого кальция. Анаэростат представляет собой металлический Цилиндр с герметически закрывающейся крышкой и кра­ном, посредством которого он присоединяется к насосу. После выкачивания воздуха кран закрывают, и анаэро­стат помещают в термостат.

Атмосферный воздух из герметически закрытых сосудов часто вытесняют каким-либо другим, индифферентным газом (например, водородом или азотом).

Химический метод.Химический метод основа на химической реакции, протекающей в герметически замкнутом сосуде, где происходит связывание свободного кислорода воздуха.

Рис. 5. Прибор Аристовского

Для этого используют пирогаллол и щелочь или гидросульфат натрия и углекислый натрий.

Посевы в пробирках и чашках Петри помещают в эк­сикатор или аппарат Аристовского (рис. 5), на дно ко­торого помещают открытую чашку Петри, насыпают углекислый натрий и гидросульфит натрия. Смесь слегка увлажняют водой и перемешивают; эксикатор гермети­чески закрывают и помещают в термостат. В результа­те химической реакции происходит поглощение кислоро­да и создаются анаэробные условия.

Биологический метод.Биологический метод предусматривает совместное культивирование аэробов и анаэробов. В герметически закрывающийся сосуд поме­щают пробирки с посевом анаэробов и аэробов из рас­чета 10—15 пробирок с посевами аэробов на 1 пробирку анаэробов. Сосуд герметически закрывают и помещают в термостат. Аэробы при сво­ем росте поглощают кислород и тем самым создают ус­ловия для роста анаэробов.

Комбинированный метод.Метод заключа­ется в комбинировании для создания анаэробных усло­вий физического метода с химическим или биологи­ческим, а также химического метода с биологическим.