Лабораторная работа № 6 Тема: Выделение чистых культур бактерий. Количественный учет микроорганизмов.

Цель работы: Научиться проводить посев на плотные и жидкие питательные среды и выделять чистые культуры бактерий. Знакомство с техникой количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер и измерения величины микробных клеток с помощью окуляр -микрометра.

Задание:

1. Провести выделение чистой культуры микроорганизмов:

- методом рассева в глубине среды;

- по методу Дригальского.

2. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорганизмов чашечным методом.

3. Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для определения микробного числа.

4. Провести количественный учет клеток дрожжей, содержащихся в предоставленной суспензии (подсчет клеток дрожжей в исходной (неразбавленной) суспензии и суспензии, разбавленной в 2,5 и 10 раз в трехкратной повторности;

5. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева при объективе 20 или40.

6. Определить: 1) цену деления окуляр - микрометра с помощью объектив - микрометра; 2) величину, размеры дрожжей.

7. Оформление протокола исследования.

Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; карандаши по стеклу; микроскоп и осветитель, объектив-микрометр, окуляр-микрометр, камера Горяева, бактериологическая петля, стерильные пипетки на 1–2 мл, капельница с водой, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор, чистые культуры грибов.

Теоретическая часть.

Чистые культуры – это потомство одной микробной клетки (без примеси других), выросшее на питательной среде.

Выделение чистой культуры микроба является основой бактериологической работы, так как чаще всего исследуемый материал содержит смесь различных видов микробов. Изучение свойств микроорганизмов и установление их видовой принадлежности возможно только при наличии чистой культуры.

Основной задачей при выделении чистых культур из материала, содержащего смесь различных микробов, является получение отдельных микробных колоний (потомство одной микробной клетки на плотной питательной среде).

При выделении чистых культур микробов из исследуемого материала, часто содержащего смесь микробов, используют различные методы: механические, химические и биологические.

Методы механического разделения микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разбавлений)заключается в том, что из исследуемого посевного материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: каплю посевного материала вносят в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую и т.д. до 8…10 колб или пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться, и можно получить такие разведения (последние), в которых во всей колбе или пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей среде, изолировать одну микробную клетку от другой будет трудно, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется для изолирования чистых культур, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микробов в материале перед его посевом в плотную питательную среду.

Метод Коха(метод пластинчатых разводок). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПА или МПЖ. Равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (количество разведений зависит от предполагаемого загрязнения материала микробами). Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. Для этого вынимаю пробку из пробирки и после обжигания края пробирки быстро выливают агар в чашку со слегка подогретым на пламени спиртовки дном, приподнимая крышку чашки настолько, чтобы прошел край пробирки. Легким покачиванием чашки агар равномерно распределяют по дну и дают ему остыть. После застывания среды посевы помещают в термостат (вверх дном, чтобы конденсат не осаждался на поверхности среды) для культивирования.

При посеве микроорганизмов на плотную среду они не могут распространяться по всей среде, как это имеет место в жидкости, а размножаются только на том месте, куда первоначально попали. Из каждой жизнеспособной клетки образуется видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов – колония.

В настоящее время этот метод применяется для выделения чистых культур редко, но имеет большое практическое значение для количественного учета микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала. Он заключается в том, что в пустую стерильную бактериологическую чашку вносится точно отмеренное количество (чаще от 1 до 0,1 см³) исследуемого материала, после чего чашка заливается расплавленным и охлажденным до45-48ºC МПА. После тщательного перемешивания посевного материала со средой и застывания агара посевы помещают в термостат и культивируют при определенной температуре для определения группы микроорганизмов.

Метод Дригальскогооснован на механическом разобщении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь на том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 2-3 дня образует колонию – массу микробных клеток. Колония образуется путем деления одной клетки и в связи с этим представляет собой чистую культуру микроорганизма (т.е. особи одного вида).

Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности среды. Этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала, номер анализа, дату посева и номер чашки, фамилию студента. Обычно в первой чашке появляется рост в виде сплошного налета. В следующих количество колоний меньше и встречаются изолированные, из которых отсевом легко выделить чистую культуру.

Метод нагреванияисследуемого материала применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (гнилостных, маслянокислых бактерий и т.д.). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85 ºC в течение 20-30 мин. Вегетативные формы погибают во время прогревания, а споры микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную среду прорастают, формируя колонии.