Техника приготовления основных питательных сред

Для культивирования микробов в лабораторных усло­виях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т. п.),искусственные,приготовленные из продуктов животного или раститель­ного происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.

Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в однородный коллоидный студень и рас­плавляющийся при 25—27° С.

В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.

Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них мик­роорганизмы должны быть хорошо видны и иметь опре­деленную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.

Питательные среды принято делить на три группы:

1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания только определен­ного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.

Стандартные питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ).В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в тече­ние часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необхо­димо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посу­ды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. За­тем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно при­готовить агар скошенной формы, пробирки с расплавлен­ным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом про­бирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ).К мясопептонному бульону добавляют 10% зимой и не менее 18—20% летом измельченного желатина и подогревают в текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН 7,2 путем добавления 10%-ного раствораNaОН. После охлаждения до 60° С осветляют яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и разливают по пробиркам. Стери­лизуют дробно по 15—20 мин три дня подряд при температуре 100° С.

Картофельная среда.Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 2—3 ч для ней­трализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики, диаметр которых должен соответство­вать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки с водой и разрезают по диагонали на две части, подсуши­вают фильтровальной бумагой и половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок используют обыч­ные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревян­ные палочки, а на них — картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20—25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и сте­рилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л ди­стиллированной воды растворяют 30 г пептона. Стерили­зуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холод­ной дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.