Protistologia

такого типа — это ген актина Oxytri­ cha1. К настоящему времени детально охарактеризованы участки ДНК, кото­ рые обеспечивают элиминацию IES-cer- ментов и правильную сшивку MDS-cer- ментов. Это специфичные короткие по­ вторы, расположенные в каждом проме­ жутке между MDS- и IES-сегментами; именно они отвечают за элиминацию IES и корректный сплайсинг2.

Когда выяснилось, что геном макро­ нуклеуса у Hymenostomatia, Stichotrichia и брюхоресничных инфузорий пред­ ставлен короткими цепочками ДНК, стали изучать макронуклеусы и других инфузорий. В некоторых группах — ряд из них не является близкими родствен­ никами гипотрих — обнаружена очень похожая организация макронуклеарно-

го генома, где ДНК представлена фраг­ ментами длиною в один ген или чуть больше. У всех исследованных цилиат в составе макронуклеарного генома были найдены молекулы ДНК, суще­ ственно уступающие по размеру нор­ мальным хромосомам. Можно предпо­ ложить, что фрагментация ДНК при развитии макронуклеуса характерна для большинства, если не для всех, инфузо­ рий.

Функциональное значение этих странных процессов реорганизации не­ понятно. В дополнение к ним, в ряде случаев обнаружен альтернативный процессинг. Это означает, что из одно­ го исходного гена, содержащегося в микронуклеусе, созревают две или бо­ лее разновидности молекул ДНК (каж-

дая размером приблизительно в один ген), обнаруживаемых в макронуклеусе. Остается выяснить, ведут ли эти про­ цессы реорганизации к большей генети­ ческой вариабельности видов и, соот­ ветственно, лучшей адаптации к изме­ нениям условий среды.

Теломеры и теломеразы

Уникальный по своей организации геном макронуклеуса цилиат, состоя­ щий из тысяч несвязанных линейных молекул ДНК, стал удобным объектом для изучения структуры и механизма формирования теломер — концевых участков эукариотных хромосом, кото­ рые выполняют стабилизирующую функцию и предотвращают потерю ко­ дирующих последовательностей при репликации. Еще одна фундаменталь­ ная функция теломер, вероятно, состо­ ит в том, что они фиксируют концы хромосом на ядерной оболочке в про­ фазе мейоза. Хромосомы, лишенные теломер, часто слипаются концами, что приводит к образованию аберрантных хромосомных конструкций.

Обеспечивая полное удвоение кон­ цов хромосом, теломеры играют ключе­ вую роль в репликации ДНК эукариот. ДНК-полимеразы работают только в направлении 5'—3' и требуют праймер для начала синтеза. Поэтому при каж­ дом цикле удвоения 5'-конец репликативной вилки укорачивается на длину праймера. В последовательных циклах репликации длина хромосом постоянно уменьшается. После того как теломерные концы, содержащие интроны, ис­ черпаны, клетка становится неспособ­ ной к дальнейшему делению. У агамно

размножающихся протистов 5'-конец восстанавливается при помощи фер­ мента теломеразы.

Изучение синтеза и функций теломер у высших эукариот было крайне затруднительно из-за их малого количе­ ства в геноме. Фрагментированный и сильно амплифицированный геном ци­ лиат содержит, в зависимости от вида, от десятков тысяч до миллионов теломер в одном макронуклеусе. Именно поэтому структура и механизмы синте­ за теломер были впервые раскрыты на инфузориях. Поскольку структура теломер очень похожа у всех организмов, выводы, полученные при изучении ин­ фузорий, правомочны для большинства эукариот.

Первыми были изучены теломеры, фланкирующие молекулу гена рибосомной РНК в макронуклеусе Tetrahymena thermophila. Затем они были детально изучены у нескольких видов гипотрих. Все эти теломеры состоят из коротких тандемных повторов (3'-G4T4-5')n у ги­ потрих и (3'-G2T4-5')50 70 у Tetrahymena. У инфузорий и некоторых других про­ тистов теломеры заканчиваются одноцепочечным З'-выступом (рис. 333). Обогащенная гуанином нить синтезиру­ ется ферментом теломеразой (теломерной терминальной трансферазой) — рибонуклеопротеином с обратной транскриптазной активностью.

Теломеразная активность впервые была обнаружена в клеточном экстрак­ те Tetrahymena, а позднее и у гипотрих. Активность этого фермента сейчас по­ казана для многих организмов, включая человека. У цилиат теломераза восста­ навливает теломеры на концах фрагмен­ тов ДНК, которые формируются при

созревании макронуклеуса. Эти теломе­ ры затем предотвращают потерю коди­ рующих последовательностей при мно­ гократных циклах репликации коротких молекул ДНК, составляющих геном макронуклеуса.

Неотъемлемый компонент теломе­ разы — молекула РНК — служит мат­ рицей при синтезе теломерных повторов (табл. 17). Теломеразная РНК была кло­ нирована из Tetrahymena и Euplotes.

У Tetrahymena она содержит последова­ тельность СААССССАА, которая ком­ плементарна TTGGGG-повтору в теломере Tetrahymena. Сходным образом, теломерная РНК Euplotes содержит после­ довательность СААААССССААААСС, которая комплементарна TTTTGGGGповтору в теломере Euplotes.

Доказательство того, что теломераз­ ная РНК служит матрицей при удлине­ нии серии теломерных повторов, было

Т а б л и ц а 17. Т е л о м е р н ы е п о в т о р ы у п р о т и с т о в

получено в изящном эксперименте с использованием мутаций. В клониро­ ванных генах теломеразной РНК произ­ водили замену одного основания. Затем клетки Tetrahymena трансформировали этими мутантными генами. Последую­ щее секвенирование ДНК показало, что в трансформированных клетках Tetra­ hymena теломеры были синтезированы на концах молекул макронуклеарной ДНК, и они содержали измененные последовательности, соответствующие точечной мутации гена теломеразной РНК. Этот эксперимент убедительно показал, что теломераза участвует в нормальном синтезе теломеры, а тело­ меразная РНК служит матрицей этого синтеза. Клетки Tetrahymena с мутант­ ными теломеразными РНК проявляют морфологические аберрации, и скорость старения клонов резко возрастает.

Одноцепочечные выступы 3'-концов теломер являются странной и непонят­ ной особенностью инфузорий. Похожие одноцепочечные хвосты обнаружены у теломер слизевика Didymium и дрож­ жей, поэтому наличие таких выступов вполне может оказаться обычной чер­ той строения теломер. Такой обогащен­ ный гуанином одноцепочечный выступ формирует шпильку. Две шпильки спо­ собны взаимодействовать друг с дру­ гом, образуя необычную структуру из 4 нитей, которые удерживаются вместе неканоническим спариванием кварте­ тов гуаниновых оснований. Благодаря этому притяжению молекулы ДНК in vitro смыкаются своими концами, фор­ мируя длинные агрегаты. Делаются по­ пытки выяснить, играют ли подобные сшивки, удерживаемые слипанием G-квартетов (или Г-тетрад), существен-

ную роль в организации хроматина in vivo. Было показано, что в агрегации теломер in vivo участвуют теломеросвязывающие белки (telomere binding pro­ tein — ТВР). Такие белки обнаружены у некоторых видов брюхоресничных инфузорий.

В то время как инфузории и другие низшие эукариоты проявляют постоян­ ную теломеразную активность, у чело­ века она выявлена только в клетках за­ родышевого пути и отсутствует в сома­ тических. Как следствие, длина теломер уменьшается с каждым делением клетки. Однако было показано, что теломераза реактивируется в клетках карциномы яичника человека, что по­ зволяет этим клеткам восстанавливать теломеры и делиться бесконечно. Соответственно, предполагают, что ин­ гибиторы теломеразы могут стать эф­ фективными антиопухолевыми препа­ ратами. У инфузорий теломераза всегда активна, и поэтому они могли бы стать удобными тест-объектами при поиске подходящих ингибиторов. Аналогич­ ным образом, ингибиторы теломеразы могли бы стать препаратами, направ­ ленными против патогенных протес­ тов. Поскольку теломеразная актив­ ность отсутствует в соматических клет­ ках млекопитающего-хозяина, инактивирующее теломеразу лекарство будет избирательно действовать на протистапаразита. Таким образом, изучение структуры теломер и функций теломе­ разы, которое началось на инфузориях, неожиданно оказалось весьма перспек­ тивным. Поэтому сейчас идут масштаб­ ные исследования компонентов теломераз, и уже началось производство их рекомбинантов.

Аутосплайсинг интронов

Особенности организации генома цилиат таковы, что они являются пре­ красными объектами для изучения экс­ прессии генов. Неожиданное открытие были сделано в результате изучения процессинга рибосомной РНК у Tetra­ hymena.

Гены рРНК Tetrahymena представле­ ны линейными палиндромными димерами и амплифицированы примерно до 10 ООО копий на макронуклеус. Каждая половинка димера содержит кодирую­ щие последовательности для 17S, 5.8S

и26S рРНК и считывается как 35S пер­ вичный транскрипт (35S пре-рРНК). У

Т.thermophila кодирующая 26S рРНК область прервана вставкой в 414 пар оснований длиной. Многие эукариотные

иединичные прокариотные гены преры­ ваются некодирующими последователь­ ностями, которые называются нитрона­ ми. Для формирования зрелой функци­ ональной формы РНК транскрипты та­ ких генов подвергаются сплайсингу При исследовании механизма сплайсин­ га, который удаляет интрон в 414 пар оснований из пре-рРНК у Tetrahymena, было показано, что он вырезается без участия белков-ферментов. Тщательней­ шим образом поставленный контроль отсекал возможность присутствия мало­ заметного белка, плотно пришитого к нуклеиновой кислоте. Все эксперимен­ ты приводили к одному и тому же выво­ ду: интрон должен обладать автокатали­ тическими свойствами. Эти интроны были названы нитронами аутосплайсинга или рибозимами.

Реакция аутосплайсинга состоит из двух стадий формирования сложных

Рис. 334 . Схема аутосплайсинга при созре ­

ит из двух экзонов, разделенных интроном . Гуанозин или гуанозиновый нуклеотид (G)

На с л е д у ю щ е м этапе интрон отделяется, а д в а экзона соединяются д р у г с д р у г о м . За ­ т е м и н т р о н з а м ы к а е т с я в кольцо; в х о д е этого п р о ц е с с а отщепляется короткий уча­ сток РНК, который у н о с и т G-остаток. Нако­ нец, кольцо интрона разворачивается в л и ­ нейную молекулу. Все эти сложные реакции идут без участия белковых ферментов (по Чеху).

эфиров и требует в качестве кофактора гуанозиновый нуклеотид или сам гуано­ зин (рис. 334). Интрон вырезается как линейная молекула и позднее конверти­ руется в кольцо, которое в конце снова

Генетический код инфузорий

Еще одна нетривиальная черта мо­ лекулярной организации инфузорий — это своеобразие их генетического кода. Из учебников известно, что генетичес­ кий код универсален, т.е. каждый из 64 возможных кодонов обозначает одну и ту же аминокислоту у всех организмов. Однако при анализе генов у различных видов инфузорий было обнаружено, что они являются исключением из этого правила. Несколько групп исследовате­ лей почти одновременно установили, что у Tetrahymena, Paramecium, Stylonichia и Oxytricha два кодона — ТАА и TAG, — которые являются универсаль­ ными стоп-кодонами в ядерных генах

Т а б л и ц а 18. О с о б е н н о с т и к о д о н о в TGA, TAG и ТАА у ц и л и а т . В я д е р н ы х генах всех д р у г и х о р г а н и з м о в э т и т р и п л е т ы с л у ж а т с т о п - к о д о н а м и .

всех других организмов, кодируют глутамин (табл. 18). Единственный стопкодон, обнаруженный в генах этих орга­ низмов, — TGA. Для Tetrahymena thermophila было показано, что она имеет три тРНК для глутамина, две из кото­ рых распознают кодоны ТАА и TGA. Сравнение сиквенсов тРНК привело к выводу, что необычная тРНК эволюци­ онировала из нормальной глутаминовой тРНК за счет мутации антикодона. Од­ нако эта история оказалась еще более запутанной. Euplotes и Blepharisma ис­ пользуют кодон ТАА, кодирующий глутамин у других цилиат, в качестве стопкодона, то есть так же, как все осталь­ ные эукариоты и прокариоты. Более того, кодон TGA (единственный стопкодон у других инфузорий) кодирует цистеин в разных генах нескольких ви­ дов Euplotes. Поскольку Euplotes отно­ сится к Hypotrichia и филогенетически связан со стиготрихами Stylonichia и Oxytricha, должно было произойти об­ ратное мутационное переключение к оригинальному значению ТАА-кодона, так же как и второе переключение в случае TGA-кодона. Причины, которые могли привести к таким изменениям генетического кода у цилиат, неизвест­

ны. Было высказано предположение, что, поскольку у инфузорий до сих пор настоящие вирусы не обнаружены, осо­ бое использование кодонов стало барь­ ером на пути вирусов.

Малярийный плазмодий: избегание иммунного ответа хозяина

Малярия — одно из наиболее тяже­ лых инфекционных заболеваний; она массово поражает население тропичес­ ких и субтропических районов земного шара. Возбудителями малярии челове­ ка являются четыре вида Apicomplexa:

Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale

и P. malariae. В настоящее время интен­ сивно изучаются различные аспекты молекулярной биологии Plasmodium, в частности структура антигенов и их локализация. Применение методов рекомбинантной ДНК и моноклональных антител позволило получить необходи­ мые сведения об антигенах, а также о структуре и изменчивости соответству­ ющих генов. Это дает возможность ис­ пользовать антигены в качестве мише­ ней для вакцин.

В некоторых странах систематиче­ ская борьба с малярией (применение антималярийных препаратов и мощных пестицидов против насекомых-хозяев) дала положительные результаты и даже привела к ее искоренению в отдельных регионах. Однако в большинстве тропи­ ческих регионов малярию не удалось подавить, напротив, ситуация ухудшает­ ся, так как появились устойчивые к пре-

паратам штаммы паразитов и невоспри­ имчивые к пестицидам комары. Да и само по себе массированное использо­ вание пестицидов наносит ущерб как состоянию окружающей среды, так и здоровью населения. Таким образом, создание эффективной вакцины стало бы колоссальным научным прорывом, имеющим огромное значение для мно­ гих миллионов людей по всему миру. Путь к разработке вакцины лежит через изучение антигенов малярийного плаз­ модия.

Малярийный плазмодий имеет сложный жизненный цикл, состоящий из половой и бесполой фазы (см. рис. 96). Значительную часть времени, в те­ чение которого осуществляется цикл, паразит проводит внутри эритроцита, заключенный в паразитофорную ваку­ оль (см. рис. 97, 98). Поэтому интере­ сующие нас антигены, вероятно, распо­ ложены на поверхности внеклеточных стадий паразита. За последние годы при помощи иммунологических и молеку­ лярных методов у видов рода Plasmo­ dium было обнаружено более 20 повер­ хностных антигенов (S-антигены1). В большинстве таких исследований ген соответствующего белка клонировали и затем экспрессировали в подходящей системе трансляции. Оказалось, что у многих из этих антигенов и пептид, и ген имеют повторы (рис. 335).

S-антиген P. falciparum был первым малярийным антигеном, в котором были обнаружены тандемные повторы олигопептидных последовательностей. Его ген состоит из единственного экзона с центральным блоком тандемных повто-

Э ! ШШКШШШ т ^ И И Д ш ^ !

г пшшшшшшшшшшшшшшшт

Рис. 335. Вариабельность сиквенсов генов поверхностных антигенов Plasmodium falci­ parum. Р а з л и ч н а я ш т р и х о в к а у к а з ы в а е т различные сиквенсы (по Кемпу).

ров. Клоны P. falciparum обладают раз­ личными наборами поверхностных ан­ тигенов. Аллели различаются по разме­ ру повтора, последовательности основа­ ний в нем, количеству повторов и поло­ жению рамки считывания. Все эти источники изменчивости обеспечивают высокое серологическое разнообразие.

Аминокислотные последовательно­ сти ряда эукариотных белков, в частно­ сти шелка, кератина и коллагена, содер­ жат многочисленные повторы опреде­ ленного мотива. У плазмодия же мотив различен в разных аллелях, и поверхно­ стные протеины обеспечивают защиту от иммунной атаки хозяина. Эта стра­ тегия напоминает систему переключе­ ния VSG трипаносом, но задействует иные молекулярные механизмы.

Геномные проекты протистов: от геномики

кпротеомике

Впоследние годы стремительно накапливается информация по последо-

вательностям нуклеотидов различных генов животных и растений. Полностью или почти полностью секвенированы геномы нескольких эукариотных орга­ низмов: человека, дрозофилы, немато­ ды Caenorhabditis, пивных дрожжей

Saccharomyces, аскомицета Neurospora,

крестоцветного Arabidopsis, риса. Наи­ более резонансным был проект «Геном человека» (HUGO). До протистов оче­ редь дошла недавно, но ряд геномных проектов уже идет полным ходом, а еще несколько планируется запустить в бли­ жайшее время. Понятно, что большин­ ство текущих проектов посвящено наи­ более важным с медицинской точки зре­ ния паразитическим протистам: Plas­ modium, Toxoplasma, Cryptosporidium, Eimeria, Entamoeba, африканские трипаносомы, Trypanosoma cruzi, Leishmania и Giardia lamblia. Однако уже нача­ ты или находятся в стадии планирова­ ния несколько геномных проектов по свободноживущим протистам, ставшим важнейшими модельными объектами молекулярно-биологических исследова­ ний (Dictyostelium, Tetrahymena и Para­ mecium).

Не следует забывать, что помимо ядерного генома клетки протистов по­ чти всегда несут митохондриальный и часто пластидный, а иногда и остатки ядерного генома бывших эндосимбионтов (см. рис. 29). Изучение этих гено­ мов привело к неожиданным открыти­ ям в филогении протистов. Так, у не­ скольких споровиков (в частности,

Plasmodium falciparum и Toxoplasma gondii) был обнаружен внехромосомный геном размером от 27 до 35 т.п.н., расположенный внутри оболочки из нескольких мембран. Анализ сиквенса

показал, что это остаток пластидного генома, поэтому органелла была назва­ на апикопластом (см. рис. 16); ее функ­ ция поныне неизвестна. Сравнение ядерных генов фермента глицеральде- гид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), который локализован в пластидах, под­ тверждает гомологию апикопласта и пластид динофлагеллат. Пластиды динофлагеллат ведут происхождение от красных водорослей. Еще более удиви­ тельно, что ген GAPDH близок по последовательности нуклеотидов гомо­ логичным генам гетероконтов и криптомонад — двух других групп, которые также прибрели пластиды в результате симбиоза с красными водорослями. Эти исследования привели к переосмысле­ нию филогенетических взаимоотноше­ ний среди протистов и абсолютно ново­ му взгляду на ранние события симбиогенеза в эволюции эукариот.

Вероятно, наибольший эффект этих масштабных исследований будет полу­ чен на следующем этапе, когда резуль­ таты различных геномных проектов будут осмыслены и обобщены. Напри­ мер, взгляды на роль цитоскелета в та­ ких важных клеточных процессах, как фагоцитоз и формирование псевдопо­ дий, принципиально обновились после исследований ранее неизвестных тубулинов и благодаря изучению генов мо­ торных белков. До недавнего времени надсемейство тубулиновых генов состо­ яло только из двух семейств: альфа-ту- булинов и бета-тубулинов. Как извест­ но, молекулы альфа- и бета-тубулина являются основными строительными блоками микротрубочек. Недавно были открыты еще по меньшей мере четыре семейства тубулинов. Постоянно увели-

чивается список эукариот, у которых обнаружен гамма-тубулин; он запуска­ ет самосборку микротрубочки. Дельта- и эпсилон-тубулины обнаружены у не­ скольких эукариотных организмов, в том числе протистов, но их распростра­ нение явно ограниченно. Дельта-тубу- лин, по-видимому, участвует в сборке жгутика Chlamydomonas. Дзета-тубулин пока найден только у кинетопластид. Функции дельта- и эпсилон-тубулинов пока не изучены.

Сходная ситуация складывается и с семействами моторных белков. По ре­ зультатам геномных проектов описыва­ ются все новые и новые гены миозина,

кинезина и динеина. От сложнейшего взаимодействия этого обширного спект­ ра белковых компонентов зависят мемб­ ранный транспорт и функционирование цитоскелета. Для изучения этих меха­ низмов уже развернута целая серия спе­ циальных исследовательских проектов. В качестве объектов задействованы Dictyostelium и Entamoeba и в меньшей сте­ пени некоторые другие протисты.

Таким образом, начаты и продолжа­ ются многие проекты полного секвенирования геномов протистов. Однако, несмотря на это, акцент в молекулярной биологии протистов все же начинает смещаться от генома к протеому1.

Реакция организма на любой вне­ шний или внутренний стимул является поведенческим актом (рис. 336). Пове­ дение протистов, равно как и высших организмов, подразделяют на два типа: один регулируется внутренне и его по­ этому можно называть спонтанным, а другой индуцируется стимулами внеш­ него мира. Исследователи предпочита­ ют изучать двигательные реакции, по­ скольку подвижность клеток легко ре­ гистрировать, но поведение может про­ являться и в менее заметных или даже дотоле неизвестных реакциях клетки.

Примеры внутренне регулируемого поведения — попятное движение и по­ вороты у стихотрих и гипотрих (Stylo-

Рис. 336 . «Брачные игры» п е р е д конъюга ­ цией Stylonichia mytilus: а — круговое вра­ щение обоих партнеров резкими толчками; б — касание п е р и с т о м а м и ; в — конъюгация (по Грелю).

nychia или Euplotes) в отсутствие сти­ мулов. Этими быстрыми перемещения­ ми управляет трансмембранный потен­ циал, величина которого у этих инфузо­ рий сильно флуктуирует. Величина по­ тенциала иногда проскакивает порог возбуждения, что вызывает вброс Са2+. В ответ на повышение концентрации кальция реснички синхронно меняют направление эффективного удара.

В отсутствие внешних стимулов клетка перемещается в случайном на­ правлении. Плавающие протисты (как, впрочем, и бактерии) обычно двигают­ ся по пологой спирали, вращаясь при этом вокруг воображаемой оси. Это происходит благодаря постоянно возни­ кающей при движении локальной асим­ метрии движущих сил. В то время как силы, возникающие из круговых со­ ставляющих перемещения, взаимно нейтрализуются, различные возникаю­ щие здесь дополнительные векторы сил складываются, и результирующий век­ тор придает плаванию единое направле­ ние. Если одноклеточный организм пла­ вает по более или менее прямолиней­ ной траектории, то имеющееся в нача­ ле эксперимента скопление клеток будет рассеиваться в толще воды; рав­ номерность рассеивания будет зависеть от начальных векторов перемещения отдельных клеток. Неподвижные и ма­ лоподвижные организмы образуют скопления. Равномерное разбегание клеток, обеспечивающее эффективное освоение среды, является результатом