Protistologia

градиентными сигналами. Каждая структура закладывается в том месте, которое предопределено величиной сигнала и, соответственно, удаленнос­ тью от его источника. Эта модель хоро­ шо объясняет формирование паттерна у Tetrahymena, а также у разноресничных и брюхоресничных инфузорий. Вторая гипотеза основана преимущественно на работах с Paramecium. Согласно этой гипотезе, поверхность клетки раз­

делена на достаточно четко очерченные зоны, которые обособлены по молеку­ лярным и структурным характеристи­ кам. Кинетосомы и связанные с ними цитоскелетные элементы предположи­ тельно играют важную роль в размеще­ нии вновь образованных структур. Сможет ли одна модель объяснить все явления формирования паттерна у ин­ фузорий, покажут дальнейшие исследо­ вания.

В настоящее время значительно усовершенствованы методы ведения культур, например, культивируются даже такие организмы, как паразити­ ческие трипаносомы и малярийный плазмодий. Вместе с тем, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позво­ ляет проводить многие молекулярнобиологические исследования, имея в наличии всего одну клетку. Эта методи­ ка дает возможность получить милли­ оны копий определенного участка ДНК. При этом нам достаточно знать всего несколько пар нуклеотидов в начале и в конце выбранного участка генома, который может насчитывать более 10 ООО пар нуклеотидов. Информация о таких фланкирующих последовательно­ стях необходима для искусственного синтеза олигонуклеотидов, которые служат праймерами для синтеза ДНК in vitro. Метод ПЦР крайне чувствителен: одна-единственная молекула ДНК в пробе может стать основой для высоко­ специфичной реакции амплификации. Внедрение этого метода позволило ре­ шить многие проблемы молекулярной биологии и достичь значительных успе­ хов в понимании молекулярных ме­ ханизмов. В будущем молекулярные исследования протистов выведут на об­ наружение новых феноменов и будут вносить все более весомый вклад в ре­ шение общих молекулярно-биологиче- ских проблем.

В последние десятилетия было по­ казано, что по сравнению с высшими организмами протисты демонстрируют поразительное многообразие не только в морфологии и экологических адаптациях, но также в биохимических и мо­ лекулярных механизмах. Развитие мо- лекулярно-биологических методов и интенсивное изучение протистов оказа­ лось взаимообогащающим:

•Несколько видов протистов стали модельными объектами в молекулярнобиологических исследованиях эукариот.

•Обнаружение уникальных моле­ кулярных особенностей, присущих не­ которым группам протистов, принципи­ ально изменило наше понимание путей молекулярной эволюции.

Вэтой главе представлены наибо­ лее яркие открытия молекулярной био­ логии протистов.

Вариабельные

поверхностные

гликопротеины

трипаносом

Африканские трипаносомы1 вызы­ вают такие серьезные заболевания, как сонная болезнь человека и нагана круп­ ного рогатого скота. Жизненный цикл наиболее исследованного вида Trypano­ soma brucei состоит из нескольких пос-

380 Избранные главы общей протистологии

ледовательных стадий (см. рис. 51). У млекопитающих паразит обитает пре­ имущественно в кровеносной системе. Когда муха це-це поглощает жгутико­ носцев при кровососании, паразиты дифференцируются в так называемые проциклические формы. Поверхность клетки у такой трипаносомы покрыта единственным типом гликопротеина — проциклином. Затем паразиты переме­ щаются из задних отделов кишечника в слюнные железы мухи, где они превра­ щаются в неделящиеся метациклические формы.

Муха це-це инфицирует млекопита­ ющее метациклическими формами трипаносом со слюной при кровососании. Поверхность клетки этой формы пара­ зита покрыта «вариабельными поверх­ ностными гликопротеинами» (variant surface glycoproteins — VSG). В этот момент у паразита обнаруживается лишь 14 или около того гликопротеинов, причем отдельная особь несет только один VSG. Замена одного гли­ копротеина на другой у этих форм про­ исходит очень быстро. Таким образом, «шуба» из VSG преадаптирует метациклических трипаносом к обитанию в млекопитающем-хозяине. Уже находясь в кровяном русле млекопитающего, па­ разит единовременно экспрессирует одну из 1000 или более имеющихся у него копий VSG гена.

В млекопитающем паразиты под­ вергаются атаке со стороны иммунной системы хозяина. Стратегия ухода от иммунной атаки состоит в изменении антигенных свойств шубы гликокалик-

са. Новые VSG экспрессируются с ча­ стотой 10~2-10~6на одно деление клет­ ки. Иммунная система хозяина перио­ дически сталкивается с новыми анти­ генными эпитопами разделившихся клеток, поэтому заражение проявляет­ ся в виде характерных паразитемических волн. Иммунная система успеш­ но истребляет большинство паразитов, но те клетки, которые при делении изменили VSG гликокаликса, ускольза­ ют от иммунного ответа и вызывают вспышку следующей паразитемической волны.

Молекулярные механизмы, стоящие за изменчивостью VSG, изучались весь­ ма интенсивно и относительно неплохо известны. Замена антигена осуществля­ ется различными путями. Упрощенная схема, иллюстрирующая два наиболее часто встречающихся, приведена на рисунке 327. Геном Т. brucei состоит примерно из 20 больших и 100 минихромосом. В них обнаружено более 1000 различных, транскрипционно пас­ сивных копий гена VSG. Эти копии тан­ демами расположены во внутренних, удаленных от теломер, участках хромо­ сом1. Несколько сайтов экспрессии ге­ на VSG располагаются субтеломерно. О сайтах экспрессии будет сказано ниже. Транскрибируется всегда только одна из VSG-копий, находящихся в субтеломерной позиции (ELC-VSG см. рис. 327). В этой связи интересно отметить, что была обнаружена необычная моди­ фикация ДНК в генах VSG: в ДНК Т. brucei был обнаружен 3-глюкозил- гидроксиметилурацил. Это основание

Замена активной копии VSG-гена идет либо за счет контроля транскрип­ ции субтеломерных сайтов, либо путем различных перегруппировок ДНК1. Один из возможных механизмов пока­ зан на рисунке 327. Альтернативный, реже встречающийся механизм замены активной копии VSG-гена — это обрат­ ная замена2.

В отличие от большинства эукариотных генов, активная VSG-копия считывается полицистронно совместно с расположенными перед ней генами — так называемыми генами, ассоцииро­ ванными с сайтом экспрессии3. Промо­ тор этого полицистронного участка рас­ положен на расстоянии около 50 т.п.н. выше VSG-гена.

Другая уникальная особенность трипаносом состоит в том, что гены VSG и проциклина считываются РНКполимеразой I. У всех других эукариот эта полимераза транскрибирует только рибосомные гены. При такой транс­ крипции первичные транскрипты этих генов не кэпируются на 5'-конце. Кэпы эукариотных мРНК играют важную роль в инициации трансляции, а также в транспортировке и обеспечении ста­ бильности молекул мРНК. У трипано­ сом мРНК приобретают кэпы в резуль­ тате уникального процесса созревания,

который называется транс-сплайсингом. Короткая РНК-донор (mini-exon donor RNA) считывается с повторяющихся последовательностей, расположенных в другом участке генома, и кэпируется. Эта РНК-донор сшивается с кодирую­ щим экзоном, полученным при полицистронном считывании (рис. 328).

Значительные успехи были достиг­ нуты в анализе структуры белков VSG и способа их прикрепления к плазмати­ ческой мембране. Для нескольких VSG известна полная последовательность аминокислот. Цепи VSG располагают­ ся на поверхности клетки трипаносомы, как колосья на поле. В состав VSG вхо­ дят олигосахариды. Структура их раз­ личается у разных трипаносом. Тополо­ гически олигосахариды подразделяют на наружные, которые венчают пептид­ ную цепь, и внутренние, которые распо­ ложены в глубине гликокаликса. Удиви­ тельно, но наружные олигосахариды не служат иммуногенетическими эпитопами; иммунодетерминантами являются только наружные белковые части VSG. Примечательно, что на трипаносомах впервые было четко показано, что по­ верхностные белки гликокаликса ковалентно связаны через этаноламин с гликозилсульфатидилинозитолом, который служит мембранным якорем (рис. 329).

Сейчас установлено, что многие мемб­ ранные белки других клеток заякориваются в мембране ковалентными связя­ ми с гликолипидным якорем.

Кинетопластная ДНК

иредактирование РНК

Вдополнение к стратегии антиген­ ной изменчивости, трипаносомы обла­ дают и другой особенностью, которая была впервые обнаружена в митохонд­ риях трипаносом: феноменом редакти­ рования РНК. Позднее этот феномен был найден и у других организмов.

Клетка Trypanosoma обладает одной гигантской митохондрией, у которой

имеется особый участок, называемый кинетопластом (см. рис. 47-50). Кинетопласт содержит необычайно большое количество ДНК. Эта митохондриальная ДНК состоит из кольцевых моле­ кул: около 50 максиколец и 10 ООО миниколец. Кольца сплетены в сложную сеть (см. рис. 50д, е). Максикольца со­ держат информацию митохондриальных генов. Функция миниколец долгое время оставалась загадкой. Казалось, что многие митохондриальные гены в ДНК максиколец не функциональны: у них нет кодонов начала трансляции или сдвинута рамка считывания. Однако выяснение последовательностей соот­ ветствующих мРНК показало, что их кодирующие области функциональны.

Это означает, что лишенная смысла последовательность ДНК преобразует­ ся в осмысленную в мРНК. Этот про­ цесс называется редактированием РНК (или иногда РНК-редактированием). У трипаносом уридин-монофосфатные (УМФ) основания вставлены в премРНК после транскрипции. У некото­ рых генов более 50% кодирующих об­ ластей не найдены в самом гене, но появляются в результате редактирова­ ния. В ряде случаев удаляется также и уридин. Степень редактирования одно­ го и того же гена различна у разных видов. Так, у одного вида определенная мРНК подвергается кардинальным из­ менениям, а тот же ген у другого вида вовсе не редактируется. Было показано, что необходимая для корректной встав­ ки или удаления уридина информация

кодируется в миникольцах. Это и есть дотоле неизвестная функция миниколец. Короткая РНК, так называемая на­ правляющая РНК (guide RNA, гидРНК), транскрибируется с миниколец ДНК и снабжает информацией процесс редактирования. Необходимо, чтобы комплементарное спаривание премРНК и направляющей РНК произош­ ло вплотную к сайту начала редактиро­ вания. Гипотетическая эдитосома, веро­ ятно, стабилизирует этот комплекс и участвует в добавлении и удалении УМФ (рис. 330).

Редактирование РНК теперь обна­ ружено и у других организмов. Оно идет в митохондриях Physarum и расте­ ний, у вирусов и даже в ядрах млекопи­ тающих. Однако механизм редактиро­ вания и его особенности у этих организ-

мов отличаются от тех, что найдены у трипаносом.

Является ли процесс редактирова­ ния РНК реликтом времен пребиотической РНК (что кажется маловероят­ ным), или он дает дополнительную эво­ люционную пластичность, или имеет другое неизвестное значение? Ответ еще предстоит найти.

Специфика

молекулярных процессов у инфузорий

В результате интенсивного изучения методами молекулярной биологии ин­ фузории стали предметом особого ин­ тереса с общебиологических позиций сразу в нескольких аспектах.

Структура генома и его преобразования

Самая яркая особенность инфузо­ рий — ядерный дуализм. Каждая клет­ ка содержит от одного до нескольких мелких микронуклеусов, которые вы­ полняют генеративную функцию, и от одного до нескольких крупных и содер­ жащих большое количество ДНК мак­ ронуклеусов, которые отвечают за сома­ тические, или вегетативные функции. Микронуклеус содержит нормальные эукариотные хромосомы и делится пу­ тем митоза или мейоза. Макронуклеу­ сы, наоборот, не имеют классических хромосом и делятся при помощи ами­ тоза. Наличие генеративного и вегета­ тивного ядер в одной клетке, а также подозрительное несходство двух типов

SI Pb Ld Lc Sc Т, Тг Т3

Рис. 3 3 1 . Разделение фрагментированной макронуклеарной ДНК Tetrahymena мето ­ д о м пульс - электрофореза . Макронуклеар-

зогнаны на агарозном геле. Для сравнения в форез включены: макронуклеарная ДНК

р ы 1 фага лямбда (Lc) и ДНК фага лямбда, обработанная гидролазами (Ld). Длина по­ втора в конкатемерах фага лямбда состав ­ ляет 49 т.п.н. Размеры фрагментов макро­ нуклеарной ДНК Tetrahymena варьируют от 20 до более 1000 т .п.н. Гораздо меньшие по размеру молекулы ДНК других видов ин ­ фузорий уходят за пределы геля п р и этих условиях.

1 Конкатемер ДНК образован тандемно повто­ ряющимися единицами генома. — Прим. пер.

ядер давно заинтересовали исследова­ телей, которые стали активно изучать организацию генома и структуру гена инфузорий.

Из тысяч видов инфузорий деталь­ но изучены лишь немногие из подклас­ са Hymenostomata (преимущественно представители родов Tetrahymena и Paramecium) и ряд видов из подклассов Stichotrichia и Hypotrichia (главным об­ разом, Stylonichia, Oxytricha и Euplotes).

Сравнения геномов микро- и макронук­ леуса у этих видов привели к обнаруже­ нию удивительных и совершенно нео­ жиданных различий в их молекулярной организации.

Новый макронуклеус начинает раз­ виваться из микронуклеуса после поло­ вого процесса (в форме конъюгации или автогамии). Незрелый макронукле­ ус называют макронуклеарным зачат­ ком. В ходе развития макронуклеуса его геном претерпевает глубокие измене­ ния. В макронуклеарном зачатке Tetra­ hymena 10-20% нуклеотидов исходного генома удаляется в ходе сложных пере­ строек. Микронуклеарная ДНК предпо­ ложительно хромосомного размера фрагментируется примерно на 200 от­ дельных молекул ДНК, размер которых варьирует от 20 до 1 500 т.п.н. (рис. 331). Самые мелкие молекулы ДНК в макронуклеусе представлены димерамн генов рРНК. Одиночный ген рРНК микронуклеарного генома вырезается и уд­ ваивается, и эти две копии сшиваются в палиндромный димер, то есть «голо­ ва к голове». В ходе фрагментации к концам всех молекул ДНК присоединя­ ются специальные теломеры. За идет амплификация; количество копий разных фрагментов неодинаково.

У некоторых цилиат происходит более кардинальная реорганизация мак­ ронуклеуса. В результате нескольких циклов репликации исходных хромосом в зачатке макронуклеуса этих видов формируются политенные хромосомы (см. рис. 302). Иногда репликация идет избирательно, и тогда разные гены по­ лучают неодинаковое количество ко­ пий. У Stylonychia удаляется до 98% нуклеотидов микронуклеарной ДНК, у других видов меньше. Причем удаляют­ ся как уникальные, так и повторяющи­ еся последовательности, и в первую очередь элиминируются транспозонподобные элементы. Наконец, ДНК фрагментируется на мелкие участки размером в один ген, насчитывающие от 100 до 15 ООО п.н. (рис. 332). У Tetra­ hymena каждый фрагмент снабжается особыми теломерами и амплифицируется до специфичного для каждого гена количества копий, которое варьирует от немногих сотен до более чем миллиона. Общая организация макронуклеарных молекул ДНК размером в ген у стихотрих и гипотрих показана на рисунке 333.

К настоящему времени более 50 ге­ нов инфузорий клонированы и полнос­ тью секвенированы. Для ряда генов уда­ лось прочесть полную последователь­ ность нуклеотидов и в микронуклеусе, и в макронуклеусе. Сопоставление этих двух версий одного и того же гена вы­ явило очередную странную черту гено­ ма инфузорий: микронуклеарные вер­ сии некоторых генов гипотрих содер­ жат так называемые внутренние элими­ нируемые последовательности (internal eliminated segments, или internal eliminated sequences — IES), которые вырезаются

А В С D E F G

Рис. 332. Макронуклеарные и микронукле­ арные ДНК различных видов инфузорий ра ­ зогнаны обычным электрофорезом на ага - розном геле. Гель окрашен б р о м и д о м э т и - дия . Дорожка А — маркер; д о р о ж к и В-Е со ­ д е р ж а т м а к р о н у к л е а р н у ю ДНК г и п о т р и х ; д о р о ж к а F — макронуклеарную ДНК Para­ mecium и д о р о ж к а G — микронуклеарную ДНК г и п о т р и х . Д л и н а ф р а г м е н т о в макро - нуклеарной ДНК гипотрих варьирует от ме­ нее 0,5 т . п . н . д о б о л е е 1 0 т . п . н . Т о н к а я структура паттерна полос макронуклеарной ДНК г и п о т р и х ( д о р о ж к и В-Е) р а з л и ч н а у различных в и д о в . М а к р о н у к л е а р н а я ДНК других инфузорий и микронуклеарная ДНК имеет много больший молекулярный вес и потому не фракционируется этим методом .

п р и ф о р м и р о в а н и и м а к р о н у к л е а р н о й в е р с и и э т о г о г е н а . Е щ е более п о р а з и т е ­ л е н т о т факт, ч т о ф р а г м е н т ы и с х о д н о г о к о д а , к о т о р ы е н е э л и м и н и р у ю т с я и с о ­ с т а в л я ю т м а к р о н у к л е а р н у ю в е р с и ю г е н а — т а к н а з ы в а е м ы е п о с л е д о в а т е л ь ­ н о с т и , п р е д н а з н а ч е н н ы е д л я м а к р о н у к ­ л е у с а ( m a c r o n u c l e a r d e s t i n e d s e q u e n ­ ces — MDS), — в и с х о д н о й в е р с и и г е н а р а с п о л о ж е н ы в и н о м п о р я д к е , а н е к о т о ­ р ы е ф р а г м е н т ы д а ж е з а п и с а н ы с з а д и н а п е р е д . П е р в ы й р а с ш и ф р о в а н н ы й г е н