Protistologia

368 Избранные главы общей протистологии

Рис. 320. Схема почкования сукторий Ерпеlota (а) и Tachyblaston (б), ма — макронук­ леус, ми — микронуклеус (по Грелю).

осевую зону цитоплазмы, в которую заходит лопасть макронуклеуса (см. рис. 129). В особом кинетосомальном поле формирующейся почки идет реп­ ликация кинетосом, которые дают нача­ ло цилиатуре бродяжки.

Множественное деление

Множественное деление быстро дает большое количество клеток. Оно часто встречается у паразитов, которые, наводняя хозяина инфекционным нача­ лом, подавляют его иммунную реакцию.

У кокцидий (например, Eimeria, см. рис. 89) и других представителей Api­ complexa и агамное размножение, и формирование гамет идет путем шизо­ гонии. После нескольких митотических делений ядра клетка разделяется на со­ ответствующее число дочерних особей. Характер развития дочерних клеток ва­ рьирует у разных родов. У Eimeria ядра мигрируют к периферии клетки (см. рис. 3036, д); спорозоиты (или мерозоиты) отделяются по периферии всей клетки в результате процесса, напоми­ нающего почкование (см. рис. 90); в центре клетки сохраняется остаточное

тело. В других родах (например, Sarcocystis) спорозоиты развиваются во внут­ ренней зоне цитоплазмы родительской клетки.

У крупных многоядерных протис­ тов, таких как Pelomyxa, бинарное де­ ление клетки идет независимо от деле­ ния ядер; количество ядер увеличивает­ ся постепенно по мере роста клетки. У фораминифер агамонт путем шизого­ нии (сопряженной с мейозом) произво­ дит гамонтов (см. рис. 162).

В жизненном цикле инфузорий Astomatia и Apostomatia (см. рис. 314) присутствует способ размножения, из­ вестный как палинтомия. Клетка пре­ терпевает серию поперечных делений без фазы роста. В результате неполно­ го разделения дочерних клеток форми­ руется цепочка особей. Представители некоторых родов (например, Radiophrya) отшнуровывают небольшие участ­ ки клетки (см. рис. 146); другие разде­ ляются на субъединицы одинакового размера (например, Haptophrya). Па­ линтомия у Foettingeria идет внутри цисты размножения.

Контроль клеточного цикла

Морфогенез у протистов тесно свя­ зан с клеточным циклом. Установлено, что важнейшие этапы эукариотного клеточного цикла — репликация ДНК. митоз, цитокинез — запускаются систе­ мой контроля клеточного цикла (рис. 321). Регуляция осуществляется в осо­ бых контрольных точках. Например, клетке не разрешается вступать в митоз до тех пор, пока ядерная ДНК не реплицирована полностью.

Основу системы контроля составля­ ют два семейства белков: одно — это циклины, которые синтезируются, раз­ рушаются и вновь синтезируются в хо­ де клеточного цикла, другое — циклинзависимые протеинкиназы (cyclin-de- pendent protein kinases, Cdk). Циклин образует комплекс с Cdk и таким обра­ зом активирует протеинкиназу для фосфорилирования определенных белков. Нормальный клеточный цикл регулиру­ ют по меньшей мере два комплекса: один работает в контрольной точке поздней 0,-фазы перед самой S-фазой, другой — в поздней G2 перед М-фазой (рис. 321).

Общий принцип таков: митотический циклин синтезируется и постепен­ но накапливается в фазе GR Он свя­ зывается с Cdk, формируя так называе­ мый активирующий фактор М-фазы (M-phase promoting factor, MPF), кото­ рый запускает ряд процессов, приводя­ щих клетку в состояние готовности к митозу. Разрушение митотического циклина инактивирует MPF, давая возмож­ ность клетке выйти из митоза. Сборка подобного комплекса из Cdk и G,-UHK- лина, по-видимому, запускает цепь со­ бытий, ведущих к репликации ДНК.

Система контроля клеточного цик­ ла наиболее детально изучена у дрож­ жей. Исследования животных и расти­ тельных клеток показали, что основной механизм универсален. Однако у дрож­ жей клеточный цикл, по-видимому, уп­ равляется единственной Cdk, которая соединяется с различными циклинами в разных точках клеточного цикла, тог­ да как в растительных и животных клет­ ках, вероятно, действуют несколько пар Cdk-циклин.

Рис. 3 2 1 . Схема с т а н д а р т н о г о клеточного цикла эукариот: две основные контрольные точки (обозначены заштрихованными круж­ ками) регулируют вступление в фазу синте ­ за ДНК (S) или в митоз (М) . Комплексы циклин - зависимых протеинкиназ (Cdk) и цик- л и н а з а п у с к а ю т п о с л е д у ю щ и е п р о ц е с с ы цикла. G, и G2 — промежуточные фазы.

Есть данные, что последняя схема регуляции реализуется и у цилиат. Тем не менее, молекулы и механизмы, уча­ ствующие в регуляции клеточного цик­ ла протистов, по-видимому, довольно разнообразны, а изучение их только начинается.

Деление Tetrahymena можно син­ хронизировать при помощи теплового шока. Показано, что он разрушает не­ устойчивый к нагреванию белок, кото­ рый накапливается перед М-фазой и, по-видимому, необходим для перехода клетки к митозу. Белок исчезает после митоза и поэтому предполагается, что это циклин.

Экстракты цитоплазмы инфузорий

Tetrahymena pyriformis, Т. thermophila и Paramecium caudatum при введении в

370 Избранные главы общей протистологии

ооциты амфибий вновь запускают у них мейоз. Этот фактор, возобновляющий мейоз (meiosis-reinitiating factor, MRIF), отличается от MPF. активирующего М-фазу. Последний не был обнаружен у Tetrahymena и Paramecium. У Tetra­ hymena MRIF представлен термола­ бильным Са2+-чувствительным раство­ римым белком. Он присутствует в мейотической и митотической стадиях, но также встречается в клетках и на стадии роста.

Многие гены, кодирующие белки семейства Cdk, были найдены у цили­ ат (Tetrahymena thermophyla, Parame­ cium tetraurelia), у жгутиковой водорос­ ли Dunaliella tertiolecta, у Dictyostelium discoideum и Plasmodium falciparum.

Три различные Cdk, которые действуют в разные периоды клеточного цикла, обнаружены у Paramecium.

Получены данные о наличии у протистов циклина. Опубликовано не­ сколько сиквенсов (в основном комп­ лементарной ДНК), которые, вероятно, кодируют циклины. Эти последова­ тельности найдены у трипаносоматид

(Leishmania mexicana, Trypanosoma brucei), инфузорий (Paramecium tetrau­ relia, Stylonychia lemnae, Tetrahymena thermophila и др.), динофлагеллат (Prorocentrum minimum, Alexandrium tamarense), Dunaliella tertiolecta, Physarum polycephalum и Dictyostelium discoi­ deum. У инфузории Eufolliculina uhligi

был идентифицирован трофонт-специ- фичный транскрипт, который, вероятно, кодирует и Cdk, и циклиноподобную молекулу. Гомолог циклина В у ди­ нофлагеллаты Cryptothecodinium cohnii

не разу не находили в ядре, но обна­ ружили в цитоплазме. При митозе он

связан с 3-тубулином митотического веретена.

Формирование паттернов у цилиат

Инфузории имеют сложный рису­ нок (паттерн) кортикальных субъеди­ ниц с точным местоположением рото­ вого аппарата, сократительной вакуоли и цитопрокта. У клетки есть переднезадняя полярность и асимметрия пра­ вой и левой сторон. Асимметрия про­ является не только на уровне клетки в целом, но и на уровне кортикальной субъединицы. Кортикальная субъедини­ ца представляет собой кинетиду, т.е. одну или две кинетосомы с отходящи­ ми корешками (см. рис. 102). Так как кинетиды специфически окрашиваются методом импрегнации серебром или методом иммунофлюоресценции (см. рис. 105), их развитие и взаимное рас­ положение легко проследить с помо­ щью светового микроскопа. При изуче­ нии принципов и механизмов форми­ рования паттерна в качестве модельных объектов используют представителей родов Stentor, Paramecium, Tetrahymena

и некоторых гипотрих. Картина разви­ тия орального аппарата (стоматогенеза) дает ценную информацию о филогене­ тических связях внутри цилиат. По­ скольку стадии стоматогенеза испыты­ вали независимое давление отбора, сравнительное изучение формирования паттернов может быть полезно для со­ здания естественной системы цилиат. Ниже представлены лишь немногие примеры формирования паттерна у ин­ фузорий.

Регенерация, реорганизация и деление

Клетка изфузории, как правило, способна восстановить эксперимен­ тально удаленные части. Однако полно­ ценной, способной расти и размножать­ ся особью станет лишь тот фрагмент, который содержит хотя бы кусочек мак­ ронуклеуса.

Как и многоклеточные организмы, инфузории значительно различаются по их регенерационной способности. На­ пример, Stentor даже из маленьких фрагментов воссоздает свою нормаль­ ную морфологию в одном поколении (хотя клетка получается меньшего раз­ мера), а у Paramecium удаленные струк­ туры восстановятся полностью лишь через несколько клеточных делений. Вероятно, у Stentor и Tetrahymena мор­ фогенез регулируется в масштабе всей клетки, а у Paramecium — локально.

Оральные структуры регулярно ре­ генерируют и без экспериментального вмешательства, деградируя перед деле­ нием клетки и позднее восстанавлива­ ясь у дочерних особей в процессе сто­ матогенеза. Это явление называется физиологической регенерацией или ре­ организацией. Оно наиболее выражено у разноресничных инфузорий, в частно­ сти Stentor, и, вероятно, связано с про­ исходящими при делении клетки ядер­ ными перестройками (консолидация макронуклеуса и последующее восста­ новление его четковидной формы, ми­ тоз микронуклеусов). Цель физиологи­ ческой регенерации — вероятно, заме­ на поврежденных частей ротового аппа­ рата или приведение размеров ротового аппарата в соответствие с измененны­

ми размерами клетки (например, в ре­ зультате уменьшения клетки после го­ лодания).

Деление клетки сопровождается серией морфогенетических событий. С одной стороны, идут процессы дегра­ дации, к примеру, частичная или полная разборка ротового аппарата. С дру­ гой — осуществляются сборка и разме­ щение в клетке новых органелл и их комплексов. Происходит удвоение со­ матических кинетид и соответствующая реорганизация цитоскелета.

Судьба элементов цитоскелета (на­ пример, кинетодесмальных фибрилл) при делении Paramecium детально про­ слежена при помощи иммунофлюоресцентной микроскопии. Уже известно, из каких зон родительской клетки проис­ ходят определенные элементы кортекса дочерних клеток (рис. 322). Морфогенетические процессы (в частности, удвое­ ние кинетосом) у Paramecium начина­ ются в районе ротового аппарата роди­ тельской особи и в районе будущей борозды деления, а затем распространя­ ются по всему кортексу. Предполагает­ ся, что этот порядок регулируется вол­ нами морфогенетических сигналов в кортексе. У делящихся парамеций обна­ ружена пробегающая по клетке волна фосфорилирования корешков ресничек, которая предшествует разборке этих корешков. Эти морфогенетические сиг­ налы по-разному воспринимаются в разных участках кортекса, и поэтому судьба субъединиц кортекса зависит от их локализации в клетке.

У брюхоресничных инфузорий цилиатура обновляется в ходе всех морфо­ генетических процессов: деления, реге­ нерации, реорганизации,эксцистирова-

ния. Кортикальный паттерн воспроизво­ дится даже в тех случаях, когда проис­ ходит полная разборка инфрацилиатуры в ходе морфогенеза, как это имеет мес­ то у Oxytricha. Так, пройдя инцистирование и эксцистирование, клетка со­ храняет индивидуальные особенности строения кортекса, в частности, абер­ рантное удвоение кинет. До сих пор не выяснено, как при отсутствии какойлибо структурной разметки клетка вос­ станавливает индивидуальный рисунок кортекса. Последние иммуноцитохимические исследования Paraurostyla weissei показали, что материал невыяснен­ ной природы, связанный в интерфазе с кинетосомами, выстраивается, высту­ пая в качестве «направляющих» морфо­ генеза. Эти направляющие, по-видимо­ му, участвуют в сопровождении клеточ­ ных компонентов к месту сборки и слу­

жат «лесами» для восстановления пат­ терна органелл.

И регенерация, и реорганизация, и деление клетки — варианты морфоге­ неза, которые не всегда удается четко разграничить. У Stentor и других гетеротрих регенерация ротового аппарата иногда приводит к делению особи. У гетеротрих же начавшееся деление клетки может закончиться ее реоргани­ зацией, если с момента предыдущего деления прошло мало времени. В ходе морфогенетических процессов проли­ ферация кинетосом в большинстве слу­ чаев сопровождается ядерными пере­ стройками: митозами микронуклеусов, конденсацией и деконденсацией четковидного макронуклеуса. Эти наблюде­ ния позволяют предположить, что су­ ществует единая система сигналов для регенерации, реорганизации и клеточ-

ного деления. Одна из современных версий механизма такова: активация циклин-зависимой протеинкиназы за­ пускает морфогенетическую перестрой­ ку цитоскелета и ядерного аппарата.

Стоматогенез

Инфузории со сложной оральной цилиатурой обычно не восстанавлива­ ют ротовой аппарат путем замены ста­ рых частей новыми. Поэтому и деление клетки, и повреждение оральных струк­ тур вызывает формирование всего рото­ вого аппарата заново особым способом, который называется стоматогенезом.

Первый этап стоматогенеза — обра­ зование новых кинетосом в особой зоне кортекса. Вместе они составляют ораль­ ный примордиум (зачаток будущей ро­ товой цилиатуры). Затем синтезируют­ ся все компоненты будущего ротового аппарата, после чего они выстраивают­ ся в строгом порядке, характерном для вида. Происхождение кинетосом зачат­ ка и ход стоматогенеза различны в раз­ ных группах цилиат. Наиболее прими­ тивными считаются инфузории с рото­ вой цилиатурой, похожей на соматичес­ кую. Такие инфузории выстраивают ротовой зачаток из фрагментов опреде­ ленных соматических кинет. Этот тип формирования зачатка называется телокинетальным и характерен для инфузо­ рий, объединяемых по этому признаку в Kinetofragminophorea. В одних случа­ ях фрагменты кинет непосредственно трансформируются в ротовую цилиатуру задней дочерней клетки (Colpoda), в других трансформация наступает после их сложного вращения и перемещения (Trithigmostoma; рис. 323а). Трансфор­

мация включает также изменения в структуре и положении кинетид. Напри­ мер, у Trithigmostoma одиночные сома­ тические кинетосомы становятся пар­ ными, то есть монокинетиды становят­ ся дикинетидами (рис. 324). У Colpoda вся ротовая цилиатура возникает из фрагментов соматических кинет, а у Furgasonia из них формируется только левая адоральная цилиатура (рис. 325а); правая же адоральная цилиатура возни­ кает из кинетосом родительской пароральной цилиатуры, которая расщепля­ ется в ходе стоматогенеза при делении клетки.

У Paramecium вся ротовая цилиату­ ра происходит из пароральных кинето­ сом родительской клетки. Следователь­ но, элементы нового ротового аппарата развиваются внутри старого. Такой тип развития называется буккокинетальным. При разделении двух оральных полей и их перемещении к месту окон­ чательной локализации в дочерних клетках происходят очень сложные сме­ щения и вращения кинетид.

В стоматогенезе Tetrahymena базальные тельца одной соматической кинеты (к1) приступают к размноже­ нию и поначалу собираются неупорядо­ ченно в так называемое анархическое поле; позднее они выстраиваются в оп­ ределенном порядке и в конечном ито­ ге формируют мембранеллы (рис. 3236, 3256). Сходный паттерн развития на­ блюдается у гипотрих (например, Рагаurostyla; рис. 325в) и гетеротрих (Sten­ tor). Однако у этих инфузорий анархи­ ческое поле формируют несколько стоматогенных кинет (у гетеротрих) или цирры (у гипотрих). И пароральная, и адоральная цилиатура возникает из

анархического поля и имеет, таким об­ разом, соматическое происхождение. Этот тип формирования ротового зачат­ ка называется паракинетальным.

Новая кинетосома формируется в большинстве случаев у основания предсуществующей. У некоторых инфузо­ рий оральные кинетосомы возникают вне видимой связи с соматической или оральной цилиатурой — это апокинетальное формирование ротового зачат­ ка. Инцистированная клетка Oxytricha fallax не содержит кинетосом, но эксцистированная клетка несет реснички, то есть кинетосомы здесь формируются de novo.

Новая кинетосома возникает в виде короткого цилиндра из неполных трип­ летов, расположенного перпендикуляр­ но к так называемой родительской кинетосоме. Созревшая кинетосома при­ крепляется к плазматической мембране, где может дать ресничку (рис. 324). За­ тем отрастают фибриллярные и микротрубочковые корешки. Кинетосомы за­ чатка ротовой цилиатуры дают начало монокинетидам, дикинетидам или поликинетидам в зависимости от вида инфузории и от того, в каком участке примордиума они расположены (рис. 324, 325). Во время сборки адоральных мембранелл Tetrahymena и Paraurosv.

сначала возникают двухрядные промембранеллы. Последующие циклы проли­ ферации кинетосом (один у гетеротрих, два у гипотрих) обеспечивают дефини­ тивное количество ресничных рядов в мембранелле (рис. 3 2 5 в ) . Сам цитостом, где собственно и формируются пище­ вые вакуоли, развивается на заключи­ тельном этапе стоматогенеза, когда оральный аппарат уже занял свое окон­ чательное положение в клетке.

Стоматогенез инфузорий — это не­ прерывная череда событий, скоордини­ рованных во времени и пространстве. Контроль этого процесса осуществляют генетические механизмы, а также морфогенетические поля, как действующие в масштабе всей клетки, так и возника­ ющие локально при взаимодействии с соседними структурами.

Например, у Stentor в формирова­ нии паттерна цилиатуры участвуют,

судя по всему, морфогенетические гра­ диенты. Продольные ряды ресничек тесно сближены на вентральной сторо­ не, но если двигаться вокруг клетки по часовой стрелке (при взгляде со сторо­ ны адорального поля), расстояние меж­ ду ними постепенно увеличивается, и, наконец, после полного оборота, наибо­ лее широко расставленные ряды при­ мыкают к наиболее сближенным рядам

(рис. 326). Эта так называемая зона кон­ траста всегда является местом форми­ рования примордиума, даже если ее

пересадить в другую часть клетки или создать новую путем микрохирургиче­ ской операции. Экспериментальное пе­ реворачивание зоны контраста дает зер­ кально отображенный ротовой аппарат (рис. 326в). В дополнение к круговому градиенту у Stentor имеется базально-

апикальный градиент. Предполагается, что ножка стентора активирует форми­ рование органелл заглатывания — вестибулума и цитостома; ее влияние по­ степенно ослабевает к переднему полю­ су клетки. Ротовой же аппарат, располо­ женный на апексе клетки, напротив, ингибирует стоматогенез. Эффект по­ давления ослабевает по мере того, как клетка растет и отношение оральной зоны к соматической становится мень­ ше. Стоматогенез инициируется, когда отношение соматической зоны к ораль­

ной достигает критической величины (что ведет к реорганизации или деле­ нию) или при экспериментальном уда­ лении ротового аппарата (что приводит к регенерации).

На основании анализа формирова­ ния паттерна у различных видов и ро­ дов инфузорий были сформулированы две гипотезы. Первая основана на кон­ цепции позиционной информации: в соответствии с ней, поверхность клет­ ки инфузории как бы несет цилиндри­ ческую систему координат, заданную