Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот в тканях органов

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

В основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) НСlО₄, 0,2 н. и 0,5 н. растворы; 2) пробирки обычные, мерные и центрифужные; 3) водяная баня; 4) центрифуга с холодильником; 5) СФ-46.

ХОД РАБОТЫ:

1. 100-200 мг измельченной на холоду ткани помещают в центрифужную пробирку с 5-10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при охлаждении.

2. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок повторно отмывают хлорной кислотой (такая обработка необходима для удаления кислото-растворимых нуклеотидов): к осадку добавляют 5-10 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. Эта процедура необходима для количественной экстракции нуклеиновых кислот из исследуемой ткани и кислотного гидролиза.

3. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

4.Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку.

5. Осадок подвергают повторной экстракции 0,5 н. раствором хлорной кислоты: к осадку добавляют 5-10 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин.

6. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

7.Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку и объединяют с полученной в п.4. Точно измеряют общий объем.

8. Определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против 0,5 н. раствора хлорной кислоты. При необходимости исследуемый раствор разводят 0,5 н. раствором хлорной кислоты.

9.Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле:

С_{фосфора} = А₂₇₀ - А₂₉₀/0,19 (мкг),

где 0,19 - значение ΔА (А₂₇₀ – А₂₉₀), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора.

При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения.

10.Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10,3:

С_нк = С_{фосфора} ∙ 10,3 (мкг).

11. Рассчитывают содержание нуклеиновых кислот в 1 г исследуемой ткани.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:

Работа №5

Количественное определение днк колориметрическим методом

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Метод основан на способности дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, давать синее окрашивание с дифениламиновым реактивом.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) дифениламиновый реактив, 1% раствор; 2) водный раствор ДНК; 3) пробирки обычные и мерные; 4) кипящая водяная баня (!); 5) КФК, кюветы шириной 5 мм.

ХОД РАБОТЫ:

1. В опытную пробирку наливают 1 мл исследуемого водного раствора ДНК и 2 мл дифениламинового реактива.

2. В контрольную пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды и 2 мл дифениламинового реактива.

3. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане 10 мин.

4.После охлаждения измеряют оптическую плотность при красном светофильтре (КФК, кюветы шириной 5 мм) против контроля.

5.Построение калибровочного графика.

В 3 пробирки помещают по 1 мл раствора ДНК с концентрациями 50, 100 и 200 мкг/мл соответственно. Добавляют в каждую пробирку по 2 мл дифениламинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность (см. п. 4).

Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентрации использованных растворов ДНК, а на оси ординат - значения оптической плотности.

Данные для построения калибровочного графика:

	Пробирка №1	Пробирка №2	Пробирка №3
Станд. р-р ДНК	1 мл	1 мл	1 мл
Концентрация ДНК	50 мкг/мл	100 мкг/мл	200 мкг/мл
Дифениламиновый реактив	2 мл	2 мл	2 мл
Оптическая плотность

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:

Работа №6