Выделение дезоксирибонуклеопротеидов (днп) из тканей

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Дезоксирибонуклеопротеиды растворяются в растворах солей средней концентрации (например, в 1М хлориде натрия) с образованием вязких растворов и снова осаждаются при разведении их (0,15М) в виде нитей нуклеопротеидов.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 2М и 1М растворы, содержащие 0,04% трехзамещенного цитрата натрия (раствор хранят в холодильнике); 2) NaOH, 0,4 и 10% растворы; 3) дифениламиновый реактив, 1% раствор (1г дифениламина, дважды перекристаллизованного из 70% спирта или петролейного эфира, растворяют в смеси 2,75 мл концентрированной серной кислоты и 100 мл ледяной уксусной кислоты); 4) CuSO₄, 1% раствор; 5) селезенка, печень.

ХОД РАБОТЫ:

1. В ступке, охлаждаемой льдом, растирают 2 г ткани органа, затем постепенно добавляют 5мл охлажденного 2М раствора хлорида натрия, содержащего 0,04% трехзамешенного цитрата натрия, и растирают в ступке еще в течение 15мин.

2. Затем, перемешивая содержимое, постепенно, малыми порциями добавляют 50 мл охлажденного 1М раствора хлорида натрия. Образовавшуюся гомогенную массу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15мин при 3000 об/мин.

3.Надосадочную жидкость после центрифугирования сливают в маленький стакан, измеряют в цилиндре объем полученного центрифугата и медленно вливают его в шестикратный объем дистиллированной воды тонкой струйкой, размешивая жидкость деревянной палочкой. Выделившиеся нити ДНП наматывают на деревянную палочку. Затем часть нитей ДНП осторожно собирают и вместе с палочкой переносят в другую пробирку.

4. Нити выделенного ДНП растворяют в 1 мл 0,4% раствора NaOH. Полученный раствор делят на две части и ставят: 1) биуретовую реакцию (на белок); 2) реакцию с дифениламином (на ДНК).

Биуретовая реакция на белковый компонент в ДНП

К 5-10 каплям раствора ДНП добавляют 10 капель 10% раствора NaOH и по 1 капле 1% раствора сульфата меди (II), Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Реакция на ДНК

При нагревании ДНП гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза дает синее окрашивание.

К раствору (15-20 капель) добавляют равный объем дифениламина, находящегося в смеси с уксусной и серной кислотами. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. Жидкость постепенно приобретает синюю окраску, обусловленную реакцией дифениламина с дезоксирибозой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:

Синтез нуклеотидов. Распределение нуклеотидов в организме.

ПЛАН:

1. Нуклеиновые кислоты – биополимерные молекулы, состоящие из трех частей – азотистого основания (пуринового или пиримидинового); сахара (D-рибозы илиD-дезоксирибозы); остатка фосфорной кислоты.

2. Минорные основания.

3. Синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов denovo. Основные этапы и метаболиты.

4. Синтез нуклеотидов из готовых продуктов.

5. Распределение нуклеотидов в организме.

6. Циклические нуклеотиды.

Распределение нуклеотидов в организме

НУКЛЕОТИДЫ
I. Построение нуклеиновых кислот ДНК РНК	II. Синтез макроэргов (АДФ) АТФ – энергетическая валюта клетки; являются субстратами и продуктами реакций окислительного, субстратного и фотосинтетического фосфорилирования. ГТФ – энергетически обеспечивает процессы трансляции белков. УТФ – обеспечивает энергией синтез гликогена. ЦТФ – участвует в синтезе глицерофосфолипидов.	III. Синтез коферментов Например АМФ: 1) никотинамидаденин-нуклеотид (НАД+) 2) никотинамидаденин-нуклеотид фосфат (НАДФ+) 3) флавинадениндинуклео-тид (ФАД) 4) S-аденозилметионин 5) КоА и др.