Структура и функции днк и рнк.
Контрольные вопросы:
1. Методы молекулярной биологии.
2. Биологическая роль нуклеиновых кислот в живых организмах. Химический состав молекул ДНК и РНК.
3. Экспериментальные исследования Герши, как доказательство роли ДНК в хранении и реализации наследственной информации.
4. Строение нуклеотидов. Минорные основания. Циклические нуклеотиды.
5. Образование дифосфоэфирных связей. Комплементарность азотистых оснований. Правила Э. Чаргаффа и выводы из них.
6. Первичная структура нуклеиновых кислот. Определение нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Метод секвенирования ДНК по Сангеру (метод Сангера-Коулсона). Метод Максама-Гилберта.
7. Вторичная структура нуклеиновых кислот. Модель ДНК, разработанная Д.Уотсоном и Ф.Криком.
8. Третичная структура ДНК прокариот и эукариот.
9. Разнообразие форм ДНК. Сверхспирализация ДНК. Топоизомеразы.
10. Физико-химические свойства ДНК и РНК. Отношение к растворителям, вязкость, механическая прочность, взаимодействие с УФ. Гиперхромный эффект.
11. Объяснить действие кислот, оснований, азотистой кислоты и температуры на ДНК. С помощью каких методов можно выявить явление денатурации и ренатурации ДНК?
12. Структура и распределение генов в молекулах ДНК. Механизмы формирования нуклеомеров, нуклеосом и хромосом. Распределение генетического материала у прокариот и эукариот.
13. Структура, свойства и функции митохондриальной ДНК. Почему митохондрии имеют собственную ДНК?
14. Структура, свойства и функции РНК.
15. Типы и распределение рибонуклеиновых кислот в клетке.
Количественное определение нуклеиновых кислот.
Работа №3
Количественное определение нуклеиновых кислот в крови
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Интенсивность образования нуклеиновых кислот в организме зависит от уровня белкового питания. Определение суммы нуклеиновых кислот - дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой - дает возможность производить весьма точные серийные определения в небольших количествах крови (методики разработаны А.С. Спириным) с использованием спектрофотометрии при λ=270-290 нм (ультрафиолетовая часть спектра) после удаления белков при помощи соляной кислоты.
Спектрофотометрические измерения производят с помощью спектрофотометра СФ-26 или СФ-46.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) кровь; 2) НСl, 0,6 н.; 3) пробирки обычные, мерные и центрифужные; 4) кипящая водяная баня (!); 4) центрифуга с холодильником; 5) СФ-46.
ХОД РАБОТЫ:
1. 0,1 мл крови размешивают в 1,4 мл воды.
2. К полученному гемолизату прибавляют 13,5 мл 0,6 н. раствора соляной кислоты (для этого лучше применять широкие центрифужные пробирки на 30-40 мл).
3. Перемешав смесь, пробирку помещают на 20 мин в кипящую водяную баню и закрывают маленькой воронкой. За это время происходит полный гидролиз нуклеиновых кислот, связанных с белками, и осаждение всех белков.
4. Пробирку охлаждают, затем центрифугируют 10-15 мин при 1500 об/мин.
5. Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку и фотометрируют в кювете шириной 10 мм при λ=270 и 290 нм против 0,6 н. раствора соляной кислоты.
6. Из среднего значения показателя, полученного при λ=270 нм, вычитают значение, полученное при λ=290 нм. Разность делят на эмпирический коэффициент 0,19 (согласно рекомендации А. С. Спирина). Получают количество фосфора в граммах (при разведении 0,1 мл крови в 150 раз).
7. Для нахождения фосфора в 100 мл крови надо увеличить полученное число в 100 раз. Чтобы вычислить содержание нуклеиновых кислот, количество фосфора умножается на коэффициент 10,3 (А.Н. Белозерский и Н.И. Проскуряков, 1951).
Т.о., подсчет нуклеиновых кислот ведут по формуле:
где
А - число, полученное при измерении раствора при λ=270 нм;
Б - число, полученное при измерении раствора при λ=290 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:
Работа №4