Методы определения титра кишечной палочки в воде

Коли-титр в питьевой воде, согласно действующему ГОСТ 2871-82 «Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством», определяют методом мембранных фильтров и бро­дильным методом. Выбор метода зависит от качества иссле­дуемой воды. При исследовании чистой, хорошо фильтру­ющейся воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. При исследовании воды, содержащей коллоидные вещества и посторонние примеси, затрудняющие процесс фильтрования, пользуются бродильным методом.

Определение титра кишечной палочки методом мембран­ных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембран­ных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37^оС, дифференцированием выросших колоний и последующим подсчетом количества бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембран­ные фильтры № 3 (без изъянов), помещают их в подогретую до температуры 80°С дистиллированную воду и ставят на слабый огонь до закипания. Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления.

2. Подготовка фильтровального аппарата. Перед посевом воды фильтровальный аппарат протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают в целях стерилизации. На охлажденный после прожигания столик фильтровального аппарата помещают с помощью стерильного пинцета с гладкими кончиками мембранный фильтр. Во избе­жание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фито­планктона, ее сначала фильтруют через предварительный фильтр № 6, помещая его поверх фильтра № 3.

На фильтровальный столик с положенными на него фильт­рами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора - воронку.

3. Фильтрование воды. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум в приемном сосуде.

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 мл. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема. Например, из водопроводной сети можно фильтро­вать 3; 30; 100; 200 мл воды, на этапах очистки - 0,1; I; 10; 100 мл.

Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 мл и меньше) в воронку сначала наливают 10 мл сте­рильной воды, а затем вносят анализируемую воду. По окон­чании фильтрования снимают воронку прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на по­верхность среды Эндо в чашки Петри.

На одну чашку можно по­местить 4-5 фильтров. Под каждым фильтром делают надпись с указанием даты, номера анализа и объема про­фильтрованной воды. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч при 37°С.

Второй день. 1. По окончании инкубации про­изводят просмотр посевов:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнару­жение на них колоний, не характерных для бактерии кишеч­ной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить иссле­дования (18-24 ч) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют. Отсутст­вие в мазках грамотрицательных, неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с регистра­цией отрицательного результата.

При обнаружении в мазке грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечной (возможны удлинен­ные, нитевидные формы или крупные полярно окрашенные палочки), ставится оксидазная проба.

2. Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomanadaсеае и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу, окисляющую фенилен-диаминовые соединения до индофенола, имеющего ярко-синий цвет.

Для постановки оксидазного теста мембранные фильтры с выросшими на них колониями переносят (не переворачивая) на лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный реактивом для выявления оксидазы (рец. 32). Результат реакции учитывают через 2-4 мин.

Колонии микроорганизмов, продуцирующие оксидазу (не относящиеся к семейству кишечных бактерий), при взаимо­действии с добавленным реактивом, приобретают синий обо­док при периферии или окрашиваются в синий цвет пол­ностью (положительная реакция).

Колонии семейства Enterobacteriaceae, не продуцирующие фермент оксидазу, не изменяют своего первоначального цвета (отрицательная реакция).

При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды заканчивается на данном этапе подсчетом выросших колоний.

При обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бакте­риям группы кишечных палочек посевом 2-3 изолирован­ных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой (Рец. 44). Результаты роста учитывают через 4-5 ч инкуба­ции в термостате при 37°С. При образовании кислоты и газа результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования - отрицательным. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончатель­ного учета результатов роста через 24 ч. При отсутствии газообразования через сутки получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования - положительный результат.

Вычисление коли - индекса. Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого посредством суммиро­вания колоний кишечных палочек, выросших на поверхности мембранных фильтров в одной пробе воды, и пересчитывают это количество на 1 л воды.

Пример. При исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. Па первом и втором фильтрах выросло по 3 колонии, на треть­ем- 9 колоний. Всего выросло 15 колоний. Таким образом, коли-индекс исследуемого образца воды равен: 1000 X 15 : 300 = 50.

Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2871-82 в том случае, когда коли-индекс не превышает 3.

При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды на наличие бактерий свежего фекального загрязнения (преимущественно колибактерий), способных ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43±0,5°С, в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры. Исследуемый образец воды фильтруют через мембранный фильтр с последующим подращиванием его на среде Эндо в течение 24 ч при 37^оС.

При повторном обнаружении на фильтрах лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском и без него параллельно определению коли-индекса эти колонии в количестве не более 15 засевают в лактозную среду с борной кислотой (рец. 143), предварительно нагретую в водяной бане до 43^оС, и 24 ч инкубируют в термостате при 43^СС. Вместо указанной среды можно пользоваться желчно- лактозной средой с бриллиантовым зеленым (рец. 142), инкубацией посевов при 44,5°С.

Помутнение с образованием кислоты и газа в посевах является показателем свежего фекального загрязнения; появление микробного роста (помутнение среды) без газообразования не учитывается.

Определение титра кишечной палочки бродильным методом. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации ее при 37°С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по таблицам.

Первый день. Для установления титра кишечной палочки бродильным методом воду в зависимости от характера водоисточника засевают во флаконы и пробирки с глюкозо-пептонной (рец. 140) или лактозо-пептонной средой (рец. 141) с поплавками или комочками ваты для выявления газообразования:

а) при исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания засевают: 100; 10; 1, 0,1 мл;

б) на выходе в водопроводную сеть - три объема по100 мл; три объема по 10 мл; три объема по 1 мл.

Посев воды в объеме 100 и 10 мл производится во флаконы и пробирки, соответственно с 10 и 1 мл концентрированной питательной среды. Посев воды в объеме 1 и 0,1 мл засевается в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Флаконы и пробирки с засеянными средами инкубируют в термостате 24 ч при 37^СС.

Второй день. 1. Учитывают результаты посевов:

а) отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках, является показателем отрицатель­ного результата на наличие бактерий группы кишечной палоч­ки в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при помутнении питательной среды с образованием кислоты и газа или помутнении и кислотообразовании (на глюкозо-пептонной среде) или только помутнении (на лактозо-пептонной среде) производится высев на среду Эндо. Высев делается бактериальной петлей, густым штрихом, для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инку­бируют 16-18 ч при 37^СС.

Третий день. 1 Просматривают посевы на среде Эндо:

а) отсутствие микробного роста или наличие пленчатых, губчатых колоний с неровной поверхностью и краями, а также плесневых и других не характерных для кишечной палочки колоний является основанием для отрицательного ответа;

б) при обнаружении лактозоположительных темно-крас­ных колоний с металлическим блеском или без него необ­ходимо установить принадлежность выросших микроорганиз­мов к семейству кишечных бактерий. С этой целью произ­водится микроскопирование материала колоний и постановка оксидазного теста.

2. Оксидазный тест при исследовании воды бродильным методом ставится следующим образом. Со среды Эндо бак­териальной петлей или стеклянной палочкой снимают по 2-3 колонии каждого типа. Снятую таким образом микроб­ную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом (рец. 32). При отрицательном резуль­тате оксидазного теста бумага в месте нанесения бактери­альной культуры цвета не изменяет. При положительном, результате - в течение минуты -приобретает ярко-синюю окраску. При постановке данного теста одним из обязатель­ных условий является исследование изолированных колоний, так как примесь оксидазоположительных бактерий может привести к ложному посинению материала и необосно­ванному исключению при подсчете колоний кишечных палочек.

Наличие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек с отрицательной реакцией оксидазного теста позво­ляет немедленно дать положительный ответ о наличии бак­терий группы кишечной палочки в исследуемой воде.

При исследовании питьевой воды учитывают розовые и бесцветные колонии. В этих случаях из 2-3 колонии разно­го типа делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных неспороносных палочек с колониями каждого типа ставится оксидазный тест. При наличии грамположительных или спорообразующих бактерий и положительном результате оксидазного теста на 40-42-м часу ведения анализа дается отрицательный результат на наличие бактерий кишечной группы исследуемого объема воды.

3. При выявлении в воде грамотрицательных, бесспоро­вых, оксидазоотрицательных бактерий из 2-3 колоний различного типа берут микробную культуру для высева в полужидкую среду с глюкозой. Результат роста учитывают после 4-5 ч инкубации в термостате при 37° С:

а) При обнаружении кислоты и газа в посеве дается положительный ответ;

6) при отсутствии кислоты и газа дается отрицательный ответ;

в) при наличии в посевах только кислоты пробирки остав­ляют еще на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования на 2-е сутки дается окончательный отрица­тельный результат, при появлении газа - окончательный положительный результат.

Таблица 2 Определение коли-индекса при исследовании 300 мл воды

Количество положительных результатов анализа воды из:				Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)		Коли-титр
3 флаконов по 100 мл	3 флаконов по 10 мл	3 флаконов по 1 мл			нижний	верхний
0	0		0	Менее 3	-	-	Более 333
0	0		1	3	0,5	9	333
0	1		0	3	0,5	13	333
1	0		0	4	0,5	20	250
1	0		1	7	1	21	143
1	1		0	7	1	23	143
1	1		1	11	1	36	91
1	2		0	11	3	36	91
2	0		0	9	1	36	111
2	0		1	14	3	37	72
2	1		0	15	3	44	67
2	I		]	20	7	89	50
2	2		0	21	4	47	48
2	2		1	28	10	149	86
3	0		0	23	4	120	43
3	0		1	39	7	130	26
3	0		2	64	15	379	16
3	1		0	43	7	210	23
3	1		1	75	14	230	13
3	1		2	120	30	380	8
3	2		0	93	15	380	11
3	2		1	150	30	440	7
3	2		2	210	35	470	5
3	3		0	240	36	1300	4
3	3		1	460	71	2400	2
3	3		2	1100	150	4800	0,9
3	3		3	Более 1100	-	-	Менее 0,9

4. Вычисление коли-нндекса. Результат анализа выража­ют в виде коли-нндекса: наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды. Величину коли - индекса определяют по таблицам. При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее коли-индекс опреде­ляют по таблицам 2 и 3.

В таблицы 4, 5 введены индексы при всех положительных и всех отрицательных результатах и даны титры (т. е. наименьшее количество воды, в котором содержится хотя бы одна микробная клетка), рассчитанные по формуле: Коли - титр = 1000/индекс.

По таблицам определяют наиболее вероятную величину индекса бактерий группы кишечных палочек, соответству­ющую полученным комбинациям положительных и отрицательных результатов.

Таблица 3 Определение коли-индекса при исследовании 500 мл воды

Количество положитель­ны результатов из 5 флаконов по 100 мл	Коли- индекс	Пределы индекса (доверительные границы)		Коли-титр
		нижний	верхний
0	Менее 2	0	6,0	Более 455
1	2	0,1	12,6	455
0	5	0,5	19,2	196
3	9	1,8	29,4	109
4	16	3,3	52,9	62

Примечание. Данные таблицы могут быть применены в тех случаях, когда воду на выходе и водопроводную сеть или из нее исследуют в объеме 500 мл.

Доверительные интервалы определяют верхний и нижний пределы, в диапазоне которых может колебаться истинное количество бактерий с 95% вероятностью. При регистра­ции результатов анализа доверительные границы не ука­зывают.

Таблица 4. Определение коли-титра

Вариант	Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах…, мл			Вычисление коли-титра, мл
	0,1	0,1	0,1
а	-	-	-	Более 0,3
б	+	-	-	0,3
в	+ +	+ +	- +	Менее 0,3

а) Если кислота и газ не обнаруживаются ни в одном из трех засеянных объемов по 0,1 мл, коли-титр считается «более 0,3 мл».

б) Если кислота и газ обнаруживаются в одном из трех засеянных объемов по 0,1 мл, коли-титр считается равным «3 мл».

Таблица 5. Определение коли-титра

Вариант	Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах…, мл					Вычисление коли-титра, мл
	1	0,1	0,01	0,001	0,0001
а	-	-	-	-	-	Более 1,1
б	+	+	+	+	+	Менее 0,0001
в	+	-	-	-	-	1,1
г	+	+	-	-	-	0,1
д	+	+	+	-	-	0,01

в) Если кислота и газ обнаруживаются в двух или трех засеянных объемах по 0,1 мл, коли-титр «менее 0,3 мл».

Для остальных продуктов коли-титр устанавливают, руководствуясь таблицей 5.

а) Если ни в одном из засеянных объемов продукта не обнаружено кислоты и газа, коли-титр считается больше суммы засеянных объемов.

б) Если кислота и газ обнаружены во всех засеянных объемах продукта, коли-титр считается менее наименьшего засеянного объема или массы продукта.

в) Если кислота и газ обнаруживаются только в одном из засеянных объемов, кол-титр равен общему засеянному объему (массе) продукта.

г) Если кислота и газ обнаруживаются в первых двух засеянных объемах, коли-титр считается «равным 0,1 мл».

д) Если кислота и газ обнаруживаются в нескольких засеянных объемах, за коли-титр принимают количество продукта в наибольшем разведении, давшем рост кишечной палочки. Если кишечная палочка обнаруживается в меньшем засеянном объеме и не обнаруживается в большем, исследование необходимо повторить.