3.Генетичні рекомбінації.

Рекомбінації - особливі феномени спадкової мінливості мікроор­ганізмів, які не пов'язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох "батьківсь­ких" клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне дже­рело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими rec-генами (recombination - рекомбінація).

Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансфор­мація, трансдукція та кон'югація.

Трансформація - процес гібридизації внаслідок переносу генетичних детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 p., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утво­рюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів III типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами II типу (R-форма) лабораторна твари­на через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи II серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова гене­тичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу. Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака переда­валась спадково.

У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компе­тентності, природа якої остаточно не з'ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка - компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клі­тинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.

Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Зго­дом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлю­ється ендонуклеазами, а інша - вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу - експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п'яти-десятихвилинного контакту клітини-реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год.

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.

Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів -представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одер­жання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.

При кон'югації внаслідок фізичного контакту між бактеріями-донорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача гене­тичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-пілі.

Вперше це явище дослідили Д. Ледерберг та Е. Тейтум на моделі кишкової палички (1946). Необхідною умовою для процесу кон'югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility - плодючість). Він є кон'югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів пе­реносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-факторами позначаються як F⁺-, а без нього - F^-- клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон'югації. Статеві ворсинки - особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує величину бактерій.

Процес кон'югації починається з того, що за допомогою статевих ворсинок клітина-донор торкається клітини-реципієнта, фіксує її та притягує до себе . Після цього плазміда починає реплікуватись, і одна її нитка переда­ється в реципієнтний штам, а інша залишаєть­ся на місті. Відбувається комплементарний син­тез іншої нитки ДНК. Таким чином, F⁺-фактор мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала кон'югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже,може сама вступати в кон'югацію.В деяких випадках F-плазміда бактерій здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон'югацію з досить високою частотою. Такий штам нази­вають штамом Hfr (high frequency of recombination - висока частота рекомбінацій). На відміну від F⁺-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон'югацію з F^--штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 5-10⁴ пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора.

Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор нази­вається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F'. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різнома­нітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон'югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування.

Явище кон'югації досліджено для багатьох представників мікроб­ного царства - кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших. Встановлено, що процес кон'югації може відбуватись не тільки в межах одного виду, але й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує на увагу факт передачі за допомогою кон'югації фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.

Трансдукція. У 1952 p. H. Ціндер І Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон'югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон'юга­ції, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бакте­ріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу фагами фрагментів ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта одержало назву трансдукції.

Вона часто відбувається в ентеробактерій, псевдомонад, стафіло­коків та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі профаг, тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищем у мікробному світі.

Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або гєнералізовану та абортивну.

Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприк­лад, фаг Е. соlі має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag і bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag і bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна. Бактеріофаг ер 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.

Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприй­нятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.

Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набува­ють токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплаз­мі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репро­дукції віріонів.

Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також фено­мени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кро­ликів, одержано фіксований вірус. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви числен­них генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivo, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.