3.2. Спороутворення (споруляція)

Спори утворюються всередині бактеріальної клітини. Цей процес починається з накопичення білкового матеріалу, тому показник заломлення у місці утворення спори збільшується. При цьому відбувається споживання запасних речовин (полі-в-гідроксимасляної кислоти у аеробів і полісахаридів у анаеробів). Упро­довж перших 5 год спороутворення значна частина білків мате­ринської клітини розкладається. При цьому утворюється специ­фічна для спор речовина — дипіколінова кислота, яка не зустрі­чається у вегетативних клітинах. У ході синтезу дипіколінової кислоти відбувається поглинання іонів кальцію; очевидно, в зрі­лих спорах ця кислота міститься у вигляді хелату з кальцієм і може становити 10—15 % сухої речовини спор. Дипіколінова кислота міститься тільки в терморезистентних спорах.

Спороутворення є одним з найскладніших процесів диферен­ціації бактеріальної клітини. Воно починається з особливого нерівномірного поділу клітини (рис.2.11).

У результаті інвагінації цитоплазматичної мембрани части­на протопласта відділяється від материнської клітини. Цей прото­пласт містить частину ядерного матеріалу — один геном. Утво­рення клітинної стінки між обома протопластами (як за звичай­ного поділу клітини) не відбувається. Замість цього протопласт чохлика. Екзоспорій міститься тільки у не багатьох бактерій (наприклад у Bacillus cereus). майбутньої спори оточується, мовби обростає, плазматичною мемб­раною материнської клітини. В результаті навкруги протопласта розміщуються дві плазматичні мембрани і кожна з них бере участь у синтезі стінки спори. Мембрана протопласта спори синтезує назовні від себе стінку зародкової клітини, а мембрана, яка похо­дить від материнської клітини, синтезує всередину кору спори (кортекс). Кортекс складається з багатошарового пептидогліканового остова, який відрізняється від каркаса стінок вегетатив­ної клітини ступенем зшивання. Зовнішню оболонку спори утво­рює материнська клітина. Ця оболонка складається з поліпепти­дів. Материнська клітина утворює також ще один додатковий поліпептидний шар — екзоспорій, який оточує спору у вигляді особливого чохлика.Єкзоспорій містеться у не багатьох бактерій.

Рис. 2.11. Спороутворення і будова зрілої спори:

А, Б — процес відділення протопласта спори; В, Г,Д — утворен­ня передспори; Е — зріла спора; 1 — цитоплазма; 2 — плазматична мембрана; 3 — клітинна стінка зародкової клітини; 4 — кора спори; 5,6 — відповідно внутрішня і зовнішня оболонки спори; 7 — екзоспоріум

Індукція спороутворення. Спори не є обов'язковою стаді­єю життєвого циклу бактерій. За сприятливих умов бактерії можуть необмежений час розмножуватися поділом, як вегета­тивні клітини. Утворення спор починається лише тоді, коли не вистачає поживних речовин або коли в надлишку накопичують­ся продукти обміну. Інакше кажучи, воно відбувається лише тоді, коли для цього створюються певні умови. Висихання не сти­мулює спороутворення. Якщо помістити вегетативні клітини в дистильовану воду, можна спостерігати "ендотрофну споруляцію", тобто утворення спор за рахунок внутрішньоклітинних запасних речовин. У таких випадках утворення спор, очевидно, викликане браком екзогенного субстрату. Індукція спороутво­рення відбувається впродовж декількох годин. Якщо, наприк­лад, до суспензії вегетативних клітин Bacillus cereus у перші 5 год після внесення їх у дистильовану воду добавити глюкозу, то утво­рення спор припиниться: добавлення субстрату пригнічує споруляцію. Але якщо глюкозу добавити пізніше, ніж через 6 год, пригнічення спороутворення не відбувається. Індукція споро­утворення продовжується, і вже через 10-13 год після внесення у воду близько 90 % клітин утворюють спори. Отже, споруляція регулюється зовнішніми факторами.Кількість клітин, що утворюють спори, у багатьох випадках збільшується після добавлення в середовище солей марганцю.

Здатність утворювати ендоспори поступово втрачається за багаторазових пересівів вегетативних клітин. Оскільки сус­пензія спороутворювальних бактерій містить і спори, і вегета-

тивні клітини, перед кожним пересіванням культуру, як пра­вило, піддають короткочасному кип'ятінню. Це сприяє збері­ганню чи підвищеній здатності клітин утворювати спори.

Властивості зрілих спор. Спори вивільнюються при авто­лізі материнських клітин. Зрілі спори не виявляють ніякої мета­болічної активності. Вони надзвичайно стійкі до дії високих тем­ператур, різного роду опромінень, хімічних агентів. Терморезистентність зумовлена низьким вмістом води у спорах — 15 % (стіль­ки само, скільки в сухому казеїні або у вовні) і приблизно про­порційна вмісту в них дипіколінової кислоти.

Проростання спор. У відповідних сприятливих умовах біль­шість спор проростають. Відповідне попереднє оброблення, певні умови зберігання та прогрівання можуть підвищити "схожість" спор — збільшити процент проростання. У випадку Bacillus subtills оптимальними умовами для стимуляції проростання спор вважають семиденний період спокою і п'ятихвилинне прогрі­вання у воді при 60 °С. Інші спори можуть бути активовані коротко­часним кип'ятінням (10 хв, 100 °С). Теплове оброблення спор повинно проводитися безпосередньо перед висіванням, оскіль­ки процес активації є зворотним.

Проростанню спор передує поглинання ними води та набу­хання. Для проростання активованих спор у ряді випадків необ­хідною є наявність глюкози, амінокислот, нуклеозидів та інших речовин. У ході проростання відбуваються глибокі фізіологічні зміни: дихання та ферментативна активність швидко підвищу­ються, починається виділення амінокислот, дипіколінової кис­лоти та пептидів. У процесі проростання втрати сухої речовини досягають 25-30 %. Під час проростання спори втрачають термо­стійкість. Ростова трубка, яка виходить із спори, оточена дуже тонкою, не до кінця сформованою клітинною стінкою, так що в протопласт може проникати навіть ДНК. Ростова трубка може утворюватись як у полярному, так і латеральному положенні {рис.2.12). В одному випадку оболонка спори при цьому розри­вається, в іншому — ростова трубка її проколює.

Тривалість життя спор. Бактерії у вигляді спор можуть три­валий час перебувати у стані анабіозу. Так, у зразках ґрунту, що зберігалися 50-100 років, були виявлені спори бацил. За даними такого роду експериментів, у сухому ґрунті за 50 років зберігання до 90 % спор втрачають життєздатність. Але при цьому 1 т сухого ґрунту навіть через 1000 років міститиме життєздатні спори.

Рис. 2.12. Проростання спори:

1,2 — полярне; 3 — латеральне; а — Bacillus cereus; б — Bacillus subtilis

У сухому стані багато бактерій (якщо не всі з них) упро­довж багатьох років зберігають життєздатність. Для консервації бактерій у колекціях культур вегетативні клітини, як правило, піддають ліофільному висушуванню (висушуванню з замороже­ного стану) і зберігають при кімнатній температурі або низьких температурах у вакуумі. Бактерії, які не витримують ліофілі-зації, зберігаються упродовж багатьох років у вигляді суспензії при температурі рідкого азоту.