Молекулярная биология клетки. Том 1
.pdf
251
II. Молекулярная организация клеток
Рис. 5.1. Электронная микрофотография окаймленных ямок и пузырьков на внутренней поверхности плазматической мембраны клетки печени. (Из
Hirokawa и Heuser, Cell 30: 395-406, 1982.)
252
Рис. 5.П. Электронная микрофотография ДНК хромосомы человека. (С любезного разрешения Paulson и Laemmli.)
253
5. Основные генетические механизмы
Способность клеток поддерживать высокую упорядоченность своей организации в хаотичной Вселенной зависит от генетической информации, которая реализуется, сохраняется, воспроизводится, а иногда и совершенствуется в четырех генетических процессах - синтезе РНК и белка, репарации ДНК, репликации ДНК и генетической рекомбинации. Эти процессы, в которых создаются и поддерживаются клеточные белки и нуклеиновые кислоты, одномерны: в каждом из них информация, заключенная в линейной последовательности нуклеотидов, используется для образования либо для изменения другой линейной последовательности нуклеотидов (молекулы ДНК или РНК) или линейной последовательности аминокислот (молекулы белка). Поэтому генетические события проще для понимания, чем большинство других клеточных процессов, связанных с выражением информации, которую несут в себе сложные трехмерные поверхности белковых молекул. Быть может, именно благодаря этой относительной простоте генетических механизмов мы знаем и понимаем их гораздо лучше, чем большую часть других событий, происходящих в клетке.
В этой главе мы рассмотрим молекулярные механизмы, обеспечивающие репарацию, репликацию и изменение клеточной ДНК. Мы увидим, что эти механизмы зависят от ферментов, расщепляющих, копирующих и рекомбинирующих нуклеотидные последовательности. Мы покажем далее, что вирусы, плазмиды и мобильные генетические элементы ведут себя в отношении этих и прочих ферментов как паразиты, не только используя их для собственной репликации, но и изменяя - посредством генетической рекомбинации - клеточный геном. Заключительная часть главы посвящена тому, как знание основных генетических механизмов реализуется практически в методиках выделения генов и генных продуктов.
Для начала, однако, мы вновь вернемся к центральной теме, уже затронутой кратко в гл. 3, а именно к механизмам синтеза РНК и белка.
5.1. Синтез РНК и белка
На долю белков приходится обычно более половины сухой массы клетки и синтез их играет главную роль в таких процессах, как рост и дифференцировка клеток, поддержание их структуры и функции. Синтез белка зависит от совместного действия нескольких классов молекул РНК и ему предшествует ряд подготовительных этапов. Сначала в результате копирования ДНК, несущей информацию о синтезируемом белке, образуется молекула матричной РНК (мРНК). Одновременно в цитоплазме клетки к каждой из 20 аминокислот, из которых строится белок, присоединяется молекула специфической транспортной РНК (мРНК), а к субъединицам рибосомы, на которой происходит синтез, присоединяются некоторые вспомогательные белковые факторы. Началом синтеза белка считается тот момент, когда эти компоненты объединяются
254
в цитоплазме, образуя функциональную рибосому. По мере того как молекула мРНК шаг за шагом продвигается сквозь рибосому, ее нуклеотидная последовательность переводится (транслируется) в соответствующую последовательность аминокислот, в результате чего создается определенная белковая цепь. Однако прежде всего необходимо ответить на вопрос о том, как образуются в клетке различные молекулы РНК.
5.1.1. РНК-полимераза «переписывает» заключенную в ДНК информацию в виде РНК: процесс транскрипции [1]
Синтез РНК на ДНК-матрице называется транскрипцией. В результате транскрипции образуются молекулы мРНК, несущие информацию
да
Рис. 5-1. Синтез молекулы РНК, катализируемый РНК-полимеразой. Фермент начинает синтез у специального старт-сигнала в ДНК, называемого промотором, и заканчивает его у стоп-сигнала (сигнал терминации транскрипции), после чего полимераза и синтезированная готовая цепь РНК отделяются друг от друга. Скорость полимеризации при 37°С составляет примерно 30 нуклеотидов в 1 с, поэтому синтез цепи РНК длиной 5000 нуклеотидов длится около 3 мин.
255
Рис. 5-2. Реакция элонгации, катализируемая ферментом РНК-полимеразой. На каждом этапе из поступающих рибонуклеозидтрифосфатов отбирается один, способный к комплементарному спариванию с открытой матричной цепью ДНК, в результате к растущему 3'-ОН-концу цепи РНК добавляется рибонуклеозидмонофосфат (цветная стрелка), а пирофосфат (выделен цветом) высвобождается. Таким образом новая цепь РНК растет в направлении 5' → 3' и оказывается комплементарной матричной цепи ДНК. Движущей силой реакции является термодинамически выгодное изменение свободной энергии, сопровождающее высвобождение пирофосфата, и гидролиз пирофосфата до неорганического фосфата. Перемещающаяся вдоль спирали ДНК РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди той точки, где происходит полимеризация, и вновь закручивает ее позади этой точки, высвобождая новосинтезированную цепь РНК. Поэтому небольшой участок РНК-ДНК-спирали (для бактериального фермента - около 17 пар нуклеотидов) существует лишь короткое время. Готовый РНК-продукт высвобождается в виде одно-цепочечной копии одной из двух цепей ДНК.
синтеза белка, а также транспортные, рибосомные и другие виды молекул РНК, выполняющие структурные и каталитические функции. Синтез этих молекул РНК, т. е. синтез РНК-копий нуклеотидных последовательностей тех или иных участков молекулы ДНК, катализируется ферментами, которые называются РНК-полимеразами. У эукариот различные виды РНК синтезируются разными РНК-полимеразами, тогда как у прокариот весь синтез РНК осуществляется одним-единственным ферментом этого типа. Почти все, что мы знаем об РНК-полимерах, было выяснено на бактериях.
Бактериальная РНК-полимераза - это крупный, состоящий из нескольких субъединиц фермент, связанный с рядом вспомогательных белковых субъединиц, которые на разных этапах транскрипции присоединяются к комплексу полимераза-ДНК, а затем покидают его (см. разд. 9.4.1). Свободные молекулы РНК-полимеразы, сталкиваясь с хромосомой случайным образом, присоединяются к большинству участков ДНК весьма непрочно. Однако эта связь оказывается очень прочной, если РНК-полимераза присоединяется к специфической последовательности ДНК, к так называемому промотору, содержащему старт-сигнал для синтеза РНК, т. е. к сайту, с которого этот синтез должен начаться. Реакции, которые за этим следуют, показаны на рис. 5.1. Присоединившись к промотору, РНК-полимераза раскручивает определенный участок двойной спирали, обнажая таким образом нуклеотиды на коротком отрезке каждой из двух цепей ДНК. Одна из этих двух разделенных цепей должна теперь служить матрицей для
256
Рис. 5-3. Перемещающаяся вдоль спирали ДНК РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди той точки, где происходит полимеризация, и вновь закручивает ее позади этой точки, высвобождая новосинтезированную цепь РНК. Поэтому небольшой участок РНК-ДНК- спирали (для бактериального фермента — около 17 пар нуклеотидов) существует лишь короткое время. Готовый РНК-продукт высвобождается в виде одноцепочечной копии одной из двух цепей ДНК.
комплементарного спаривания оснований ДНК с основаниями поступающих мономеров - рибонуклеозидтрифосфатов; полимераза соединяет между собой два первых поступающих мономера и тем самым кладет начало синтезируемой цепи РНК. Затем РНК-полимераза, продвигаясь шаг за шагом вдоль ДНК, раскручивает перед собой спираль ДНК, обнажая всякий раз новый участок матрицы для комплементарного спаривания оснований. Таким путем, добавляя к растущей цепи РНК по одному нуклеотиду, она постепенно наращивает эту цепь в направлении 5' → 3' (рис. 5- 2). Процесс удлинения цепи РНК продолжается до тех пор, пока фермент не встретит на своем пути еще одну специфическую нуклеотидную последовательность в цепи ДНК, а именно сигнал терминации транскрипции (стоп-сигнал). Достигнув этой точки, полимераза отделяется и от матричной ДНК, и от новосинтезированной цепи РНК (см. также рис. 5-6, 6).
Во время продвижения фермента вдоль матричной цепи в его активном центре образуется двойная спираль РНК-ДНК. Она очень коротка, так как позади молекулы полимеразы немедленно восстанавливается спираль ДНК-ДНК, а РНК вытесняется (рис. 5-3). Поэтому каждая завершенная цепь РНК отделяется от ДНК-матрицы в виде свободной одноцепочечной молекулы, в которой число нуклеотидов колеблется обычно от 70 до 10000.
5.1.2. Промоторная последовательность определяет, какая именно цепь ДНК будет транскрибироваться [2]
В принципе любой участок ДНК может быть транскрибирован с образованием двух различных молекул мРНК - по одному на каждую из двух цепей двойной спирали ДНК. В действительности же в любом участке ДНК транскрибируется только одна из двух цепей, так как образовавшаяся РНК соответствует по своей нуклеотидной последовательности другой, нематричной цепи ДНК. Какая из двух цепей будет транскрибироваться, определяется промотором, нуклеотидная последовательность которого ориентирована таким образом, чтобы направить РНКполимеразу на тот или иной путь. Поскольку цепи РНК растут лишь в направлении 5' → 3', именно от промотора зависит выбор цепи ДНК для транскрипции (рис. 5-4). У двух соседних генов нередко транскрибируются разные цепи ДНК, как это можно видеть на рис. 5-5, где изображен небольшой участок хромосомы.
Анализ (см. разд. 4.6.6) показывает, что РНК-полимераза Е. coli, присоединяясь к промотору, охватывает довольно большой участок
Рис. 5-4. Поскольку цепь ДНК, выполняющая функцию матрицы, должна считываться от 3'-конца к 5'-концу (см. рис. 5-2), выбор одной из двух цепей ДНК на роль матрицы для синтеза РНК определяется направлением движения РНК-полимеразы. В свою очередь направление движения РНКполимеразы задается ориентацией нуклеотидной последовательности промотора, с которого РНК-полимераза начинает считывание.
257
Рис. 5-5. Короткий участок типичной бактериальной хромосомы. Схема показывает, каким образом происходит транскрипция ДНК, связанная с экспрессией нескольких соседних генов.
ДНК: примерно 40 нуклеотидов «вверх» и 20 нуклеотидов «вниз» от старт-сигнала, т. е. от места начала транскрипции. Сравнение многих последовательностей ДНК, играющих роль сильных промоторов для этой полимеразы, показало, что она узнает в молекуле ДНК в первую очередь две строго определенные (консервативные) шестинуклеотидные последовательности, расположенные выше старт-сигнала и отделенные одна от другой приблизительно 17 нуклеотидами (рис. 5-6, Л). Такие консервативные последовательности, обнаруживаемые во всех образцах определенного типа регуляторных участков ДНК, носят название консенсусных последовательностей (consensus sequences). В результате сравнения многих промоторов Е. coli были выявлены две консенсусные шестинуклеотидные последовательности: T82T84G78A65C54A95 и Т80А95Т45А60А50Т96 (цифры показывают ожидаемую частоту (в процентах), с которой данный нуклеотид встречается в указанном положении последовательности: 100 означает, что он присутствует здесь всегда, а 25, что из четырех промоторов он встречается в одном). Последовательности сильных промоторов, как правило, довольно близки к этим двум консенсусным последовательностям, у слабых же промоторов (связанных с генами, продуцирующими сравнительно мало мРНК) это сходство менее выражено.
Клетки эукариот содержат три разные РНК-полимеразы. Одна из них
Рис. 5-6. Старт- и стоп-сигналы для РНК-полимеразы, осуществляющей синтез РНК у Е. coli, Обратите внимание, что матричной цепью служит нижняя цепь ДНК, верхняя же по своей нуклеотидной последовательности соответствует синтезированной РНК (за исключением того, что вместо Т, присутствующего в ДНК, в РНК стоит U). Принято указывать нуклеотидную последовательность применительно к нематричной цепи. А. Полимераза начинает синтез у промоторной нуклеотидной последовательности. Считается, что прикрепление полимеразы определяют два коротких участка (выделены красным), отстоящие от начала синтеза РНК приблизительно на 35 и 10 нуклеотидов, вместе с точкой начала синтеза эти последовательности образуют промотор. Сколько-нибудь значительные модификации в любой из них ведут к утрате промоторной активности, изменения в других участках цепи ДНК такого эффекта не вызывают. Б. Полимераза прекращает синтез, после того как будет синтезирован участок из нескольких остатков U (что соответствует нескольким А на матрице) и самокомплементарная нуклеотидная последовательность (выделена серым). Соответствующее сочетание нуклеотидных последовательностей в ДНК служит стоп-сигналом. Порядок нуклеотидов в самокомплементарной последовательности может быть различным, решающим для прекращения транскрипции является быстрое образование в этом участке новосинтезированной РНК двойной спирали - так называемой шпильки.
258
катализирует синтез всех РНК, кодирующих белок (т.е. мРНК), тогда как две другие синтезируют молекулы РНК, выполняющие структурные или каталитические функции (например, рибосомные и транспортные РНК). Все три РНК-полимеразы представляют собой крупные мультимерные молекулы, напоминающие бактериальный фермент, но промоторы, которые они узнают, сложнее по своему строению и пока еще не столь хорошо изучены (см. разд. 9.4.3). Неясно, почему столь сложны молекулы и бактериальной РНК-полимеразы, и РНК-полимеразы эукариот. Эти молекулы состоят из нескольких субъединиц с общей массой свыше 500 000 дальтон. Между тем известно, что РНК-полимеразы некоторых бактериофагов, состоящие из одной цепи и имеющие впятеро меньшую массу, катализируют синтез РНК не менее эффективно, чем соответствующий фермент клетки-хозяина. Можно предположить, что мультимерное строение клеточных РНК-полимераз имеет какое-то отношение к регуляторным аспектам клеточного синтеза РНК, пока еще недостаточно хорошо выясненным.
В приведенном выше описании транскрипции ДНК опущены многие подробности; обычно синтез молекулы мРНК включает и ряд других сложных этапов. Известно, например, что в определении того, какие участки ДНК будут транскрибироваться РНК-полимеразой, важную роль играют особые белки, регулирующие активность генов, а значит, именно от них в первую очередь и зависит, какие белки будет вырабатывать клетка. Далее, в то время как у прокариот молекулы мРНК образуются непосредственно путем транскрипции ДНК, в клетках высших эукариот большинство РНК-транскриптов, прежде чем покинуть клеточное ядро и перейти в цитоплазму в виде мРНК, претерпевает существенные изменения - подвергается сплайсингу. Все эти аспекты процесса образования мРНК мы обсудим в гл. 9 и 10, где речь пойдет о клеточном ядре и о регуляции экспрессии генов. Здесь же мы просто будем исходить из того, что в клетке так или иначе образуются функциональные молекулы мРНК,
ипознакомимся с тем, как они направляют белковый синтез.
5.1.3.Молекулы транспортных РНК служат адаптерами, переводящими нуклеотидные последовательности в аминокислотные [3]
Во всех клетках имеется набор транспортных РНК (тРНК)- небольших молекул, размеры которых колеблются от 70 до 90 нуклеотидов. Эти РНК, присоединяясь одним своим концом к специфическому кодону мРНК, а другим присоединяя аминокислоту, кодируемую данным триплетом, позволяют аминокислотам выстраиваться в порядке, диктуемом нуклеотидной последовательностью мРНК. Каждая тРНК может переносить только одну из 20 аминокислот, используемых в синтезе белка. Транспортную РНК, переносящую глицин, обозначают тРНКGly и т. д. Для каждой из 20 аминокислот имеется по меньшей мере один тип тРНК, для большей же части аминокислот их имеется несколько. Прежде чем включиться в синтезируемую белковую цепь, аминокислота присоединяется своим карбоксильным концом к 3'-концу соответствующей молекулы тРНК. Этим достигаются две цели. Во-первых, и это наиболее важно, аминокислота ковалентно присоединяется к тРНК, содержащей правильный антикодон - трехнуклеотидную последовательность, комплементарную трехнуклеотидному кодону, определяющему эту аминокислоту в молекуле мРНК. Спаривание кодона с антикодоном позволяет каждой аминокислоте включиться в растущую белковую цепь в том порядке, который диктуется нуклеотидной последовательностью мРНК, так что генетический код используется для перевода (трансляции)
259
Рис. 5-7. Строение типичной молекулы тРНК. Слева представлен механизм спаривания оснований в соответствующих участках молекулы (структура «клеверного листа»), а справа - общая трехмерная информация молекулы, установленная с помощью дифракции рентгеновских лучей. Отметим, что молекула напоминает по форме букву L, один ее конец (акцепторный) предназначен для присоединения аминокислоты, а второй содержит антикодон, состоящий из трех нуклеотидов. Аминокислота присоединяется к остатку А последовательности ССА на 3'-конце молекулы
(см. рис. 5-11).
нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот в аминокислотные последовательности белков. В этом заключается важная «адапторная» функция тРНК: присоединяясь одним концом к аминокислоте, а другим спариваясь с кодоном, тРНК переводит последовательность нуклеотидов в последовательность аминокислот.
Вторая цель, достигаемая присоединением аминокислоты к тРНК, заключается в том, что аминокислота таким путем активируется - на ее карбоксильном конце возникает богатая энергией связь, что дает ей возможность реагировать с аминогруппой соседней аминокислоты в данной аминокислотной последовательности, т, е. возможность образовать пептидную связь. Этот процесс активации - необходимый этап белкового синтеза, поскольку неактивированные аминокислоты не могут прямо присоединяться к растущей полипептидной цепи. (Спонтанно способен идти лишь обратный процесс - гидролитический разрыв пептидных связей.)
Функция тРНК зависит от трехмерной структуры ее молекулы. Несколько видов тРНК удалось получить в кристаллическом виде, что позволило определить их точную структуру методом рентгеноструктурного анализа. Для надлежащего свертывания молекулы тРНК требуется комплементарное спаривание оснований и взаимодействие необычных оснований (см. разд. 3.2.9, рис. 3-16). Изучение вторичной структуры молекулы тРНК из многих различных организмов показало, что она имеет вид «клеверного листа»; полагают, что петли и прямолинейные отрезки этой структуры затем свертываются дополнительно, вследствие чего возникает обнаруживаемая кристаллографическим анализом L-кон-формация (рис. 5-7). К одному концу этой «буквы» присоединяется аминокислота, а на другом конце находится антикодон (рис. 5-8).
В готовой цепи нуклеиновой кислоты нуклеотиды (подобно аминокислотам в белках) могут претерпевать ковалентную модификацию, приводящую к изменению активности данной нуклеиновой кислоты. Такие посттранскрипционные модификации особенно свойственны молекулам тРНК, в которых обнаруживается много модифицированных нуклеотидов (рис. 5-9). Некоторые из них оказывают влияние на конформацию и на спаривание оснований антикодона, что облегчает узнавание соответствующего кодона мРНК молекулой тРНК.
Рис. 5-8. Пространственная модель молекулы тРНК с присоединенной аминокислотой. Существует много различных видов тРНК - не менее одного на каждую аминокислоту. Хотя эти молекулы тРНК различаются по своей нуклеотидной последовательности, все они свернуты сходным образом. Изображенная здесь молекула тРНК связывает аминокислоту фенилаланин, поэтому ее условно обозначают тРНКРЬе. (С любезного разрешения
Sung-Hou Kim.)
260
Рис. 5-9. Некоторые необычные нуклеотиды, встречающиеся в молекулах тРНК. Они возникают в результате ковалентной модификации обычного нуклеотида уже после того, как он включился в полинуклеотидную цепь. В большинстве молекул тРНК подобным образом видоизменено
приблизительно 10% нуклеотидов (см. рис. 5-7).
5.1.4. Каждая аминокислота присоединяется к соответствующей молекуле тРНК при помощи специфического фермента [4]
В каком именно месте будет присоединена к растущей полипептидной цепи данная аминокислота, зависит не от самой аминокислоты, а от присоединившей ее молекулы тРНК. Выяснить это удалось при помощи изящного эксперимента, в котором аминокислоту, присоединенную к специфической тРНК, химическим путем превращали в другую аминокислоту (цистеин в аланин). Когда затем такие гибридные молекулы участвовали в синтезе белка в бесклеточной системе, неправильная аминокислота включалась в белковую цепь во всех тех положениях, которые «обслуживались» данной тРНК. Успешное декодирование, следовательно, решающим образом зависит от точности того механизма, который в норме обеспечивает связь между каждой активированной аминокислотой и соответствующей молекулой тРНК.
Почему молекула тРНК ковалентно присоединяется именно к той аминокислоте из всех двадцати стандартных аминокислот, которая и является ее настоящим партнером? Механизм этот связан с участием ферментов, называемых аминоацил-тРНК-синтетазами, которые присоединяют каждую аминокислоту к соответствующему набору молекул тРНК. Для каждой из аминокислот имеется своя особая синтетаза (всего таких синтетаз 20): одна присоединяет глицин к тРНКGlу, другая - аланин к тРНКА1а и т. д. Реакция присоединения протекает в два этапа, как это видно на рис. 5-10, и приводит к образованию молекулы аминоацил-тРНК. Характер связи аминоацил-тРНК ясен из рис. 5-11.
Молекулы тРНК играют роль конечных «адапторов», переводящих информацию, заключенную в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, на язык белка. Не менее важную роль, однако, играет и второй набор молекул - ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз. Таким образом, генетический код расшифровывается при помощи двух последовательно действующих посредников, каждый из которых осуществляет высокоспецифическую подгонку одной молекулярной поверхности к другой; в результате совместного действия этих адап-