Молекулярная биология клетки. Том 1
.pdf
291
цепи ДНК. Поэтому, хотя механизм репликации ДНК, изображенный на рис. 5-39, кажется на первый взгляд значительно более сложным и громоздким, чем неверный гипотетический механизм, представленный на рис. 5-38, этот реально функционирующий механизм способен обеспечить гораздо большую точность именно в силу того, что синтез ДНК идет здесь только в направлении 5' → 3'.
5-25
5.3.5. Для синтеза коротких затравочных молекул на матрице отстающей цепи требуется особый фермент [28]
С того момента, как возникла репликационная вилка, для ДНК-полимеразы, синтезирующей ведущую цепь, всегда есть спаренный 3'- конец, необходимый ей для того, чтобы начать синтез новой цепи. Иначе обстоит дело с ДНК-полимеразой, ответственной за синтез отстающей цепи. Ей требуется всего каких-нибудь 4 с для того, чтобы синтезировать один короткий фрагмент ДНК, после чего она должна переключиться на синтез совсем другого фермента на новом участке матричной цепи, расположенной на некотором расстоянии от первого (см. рис. 5-39). Для этого ей всякий раз нужна затравка со спаренным 3'-концом, а следовательно, нужен и механизм, способный производить такие затравки. В этот механизм входит фермент, называемый ДНК-праймазой. Она синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (рис. 5-42). Эти затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице для отстающей цепи; здесь их наращивает ДНК-полимераза, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает это наращивание до тех пор, пока она не достигнет РНК-затравки, присоединенной к 5'-концу предыдущего фрагмента ДНК. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, быстро удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. Завершает процесс ДНК-лигаза, соединяющая 3'-конец нового фрагмента ДНК с 5'-концом предыдущего фрагмента (рис. 5-43).
Почему предпочтение отдается удаляемой РНК-затравке, а не ДНК-затравке, которую не требовалось бы удалять? Выше мы отмечали, что самокорректирующая полимераза не способна начинать синтез полинуклеотидных цепей de novo; это предполагает и обратное утверждение: тот фермент, который начинает синтез цепей de novo, к эффективной самокоррекции не способен. Значит, любой фермент, катализирующий инициацию синтеза фрагментов Оказаки, неизбежно создал бы не слишком точную копию (не менее 1 ошибки на 105). Это означало бы колоссальное увеличение частоты мутаций даже при том, что количество
Рис. 5-42. Схема реакции, катализируемой праймазой - ферментом, синтезирующим короткие РНК-затравки в отстающей цепи ДНК. В отличие от ДНК-полимеразы этот фермент способен начинать синтез новой полинуклеотидной цепи с соединения двух нуклеозидтрифосфатов. Образовав короткий полинуклеотид, праймаза прекращает работу. Теперь к свободному 3'-концу может добавлять нуклеотиды ДНК-полимераза.
292
таких копий, сохранившееся в конечном продукте, составляло бы не более 5% всего генома (например, 10 нуклеотидов во фрагменте, состоящем из 200 нуклеотидов). Естественно думать поэтому, что выдвижение РНК, а не ДНК на роль затравки обеспечивало важное преимущество, поскольку рибонуклеотиды автоматически метят такие последовательности, как «плохие копии», которые должны быть удалены.
5-26
5-33
5.3.6. Особые белки способствуют расплетанию двойной спирали ДНК перед репликационной вилкой [29]
Двойная спираль ДНК должна расплетаться по ходу продвижения репликационной вилки, для того чтобы поступающие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли спариваться с родительской матричной цепью, Однако в обычных условиях двойная спираль ДНК весьма стабильна; спаренные основания соединены столь прочно, что для разделения двух цепей ДНК в пробирке требуются температуры, приближающиеся к точке кипения воды (90°С). По этой причине большинство ДНК-полимераз может копировать лишь ту молекулу ДНК, у которой матричная цепь уже отделилась от другой цепи. Для того чтобы двойная спираль ДНК раскрылась и соответствующая матричная цепь стала доступной для ДНК-полимеразы, необходимы особые белки. Они бывают двух типов.
ДНК-геликазы были впервые выделены как белки, которые, присоединяясь к одиночной цепи ДНК, катализируют гидролиз АТР. Как уже отмечалось в гл. 3, гидролиз АТР может циклическим образом изменять форму молекулы белка, вследствие чего белок будет производить механическую работу (см. разд. 3.4.11). Именно этот принцип лежит в основе быстрого перемещения ДНК-геликаз по одиночной цепи ДНК. Встречая на своем пути участок двойной спирали, эти ферменты продолжают двигаться вдоль своей цепи и тем самым расплетают двойную спираль (рис. 5-44). Расплетание ДНК-спирали в области репликационной вилки, вероятно, осуществляется двумя совместно действующими ДНКгеликазами, одна из которых перемещается по ведущей цепи, а другая - по отстающей. Ясно, что две эти геликазы должны двигаться вдоль одиночных цепей ДНК в противоположных направлениях, т. е. это должны быть разные ферменты. Действительно, оба указанных типа ДНКгеликаз удалось обнаружить. При этом исследования на бактериях показали, что главную роль играет ДНК-геликаза отстающей цепи. Причины этого мы обсудим ниже.
Белки, дестабилизирующие спираль (их называют также белками, связывающими одноцепочечную ДНК или SSB-белками), связываются с одиночными цепями ДНК, не закрывая оснований, т. е. оставляя их доступными для спаривания. Сами они не способны расплетать длинные молекулы ДНК, но, присоединяясь к одиночным цепям ДНК, они тем самым способствуют любому процессу расплетания спирали; они, например, помогают ДНК-геликазе расплетать двойную спираль в репликационной вилке. На матрице отстающей цепи SSB-белки кооперативным образом связываются с одноцепочечными участками ДНК и предотвращают здесь образование «шпилек», небольших двухспиральных структур, которые могли бы помешать синтезу ДНК, осуществляемому ДНК-полимеразой (рис. 5-45).
Рис. 5-43. Отдельные этапы синтеза каждого из фрагментов отстающей цепи ДНК. У эукариот РНК-затравки синтезируются в отстающей цепи с интервалами приблизительно в 200 нуклеотидов и каждая из них состоит из 10 нуклеотидов.
293
5.3.7. Белки в репликационной вилке действуют кооперативно, образуя «репликационную машину» [30]
До сих пор мы говорили о репликации ДНК так, как если бы она осуществлялась смесью репликационных белков, действующих независимо друг от друга. Между тем в действительности большая часть этих белков объединена в крупный мультиферментный комплекс, быстро движущийся вдоль ДНК. Этот комплекс - нечто вроде крошечной «швейной машины»: «деталями» его служат отдельные белки, а источником энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифосфата. Комплекс изучен достаточно хорошо только у бактерий Е. coli и у некоторых вирусов, но есть все основания считать, что очень похожий механизм действует и у эукариот (см. разд. 9.3.3).
Схема на рис. 5-46, где подробно изображена репликационная вилка, позволяет судить о том, как работают отдельные части такой «репликационной машины». В области вилки действуют две идентичные ДНК-полимеразы - на ведущей и на отстающей цепи. Спираль ДНК расплетается в результате совместного действия ДНК-полимеразы, работающей на ведущей цепи, и ДНК-геликазы, движущейся вдоль отстающей цепи; этому процессу способствуют кооперативно связывающиеся молекулы дестабилизирующегося белка. В то время как на ведущей цепи ДНКполимераза работает непрерывно, на отстающей цепи фермент через определенные интервалы прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя для полимеризации короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой.
Эффективность репликации сильно возрастает вследствие тесного объединения всех этих белковых компонентов. Молекула праймазы непосредственно сцеплена с ДНК-геликазой, образуя вместе с нею на отстающей цепи структуру, называемую праймосомой, которая движется с репликационной вилкой и по ходу своего движения синтезирует РНК-затравки. Молекула ДНК-полимеразы, работающая на отстающей цепи, также движется совместно с остальными белками, синтезируя ряд новых фрагментов Оказаки; ради этого, как полагают, цепь ДНК, которая служит для нее матрицей, складывается сама на себя, как это показано на рис. 5-47. Репликационные вилки оказываются, таким образом, объединены в одну крупную структуру (с общей массой > 106 дальтон), быстро перемещающуюся вдоль ДНК и обеспечивающую
Рис. 5-44. Действие ДНК-геликаз. Небольшой фрагмент ДНК присоединен путем отжига к длинной одноцепочечной ДНК, так что образовался короткий участок двойной спирали. Эта спираль расплетается по мере того, как геликаза движется вдоль одиночной цепи ДНК, катализируя реакцию, для которой требуется наряду с ферментом и АТР. Источником энергии для движения геликазы служит гидролиз АТР (см. рис. 3-63).
Рис. 5-45. Влияние дестабилизирующих белков на структуру одно-цепочечной ДНК. Поскольку каждая белковая молекула предпочитает связываться с другой, уже связавшейся ранее молекулой (так называемое кооперативное связывание), эти белки образуют длинные кластеры, выпрямляющие матричные пени ДНК и облегчающие процесс полимеризации. Структуры в форме «шпильки», возникающие в свободной одноцепочечной ДНК, образуются путем случайного спаривания оснований в коротких участках, содержащих взаимно комплементарные
последовательности нуклеотидов, они напоминают короткие спирали, возникающие во всех молекулах РНК.
294
Рис. 5-46. Главные типы белков, действующих в области репликационной вилки (схема показывает их локализацию на ДНК). Комплекс ДНКпраймазы и ДНК-геликазы на отстающей цепи ДНК известен под названием праймосомы.
возможность координированного и эффективного синтеза ДНК на обет ветвях вилки.
Позади «репликационной машины» по ходу ее движения остается на отстающей цепи ряд несшитых фрагментов Оказаки, все еще содержащих на своем 5'-конце РНК-затравки, необходимые для инициации на синтеза. Эти РНК-затравки должны быть удалены, а фрагменты сшиты при помощи репарирующих ферментов, работающих позади репликационной вилки (см. рис. 5-43).
Рис. 5-47. Схема, иллюстрирующая современные представления о расположении репликационных белков в движущейся репликационной вилке. Вместо двумерной структуры, изображенной на рис. 5-46, здесь показано, как ДНК на отстающей цепи складывается, в результате чего возникает комплекс из двух ДНК-полимераз - ведущей и отстающей цепи. Кроме того, благодаря складыванию 3'-конец каждого завершенного фрагмента Оказаки оказывается рядом со стартовым участком следующего такого фрагмента (ср. с рис. 5-46). Находясь в тесном контакте с остальными репликационными белками, молекула ДНК-полимеразы отстающей цепи может непрерывно работать на одной и той же репликационной вилке, отделяясь от готового фрагмента ДНК, она переходит к ближайшей новой РНК-затравке, чтобы начать синтез следующего фрагмента. Обратите
внимание, что на этой схеме одна из дочерних спиралей ДНК направлена вправо и вниз, а вторая влево и вверх.
295
5.3.8. Ошибки при репликации ДНК в бактериальных клетках устраняются особой корректирующей системой, распознающей неправильное спаривание оснований
У таких бактерий, как Е. coli, деление происходит каждые 30 мин, поэтому у них сравнительно легко выявить в большой популяции клеток редкие экземпляры с измененными признаками. Выделен, например, класс мутантов, характеризующихся резким повышением частоты спонтанных мутаций, что связано с присутствием в его клетках специфических генов-мутаторов. Известен ген-мутатор, кодирующий дефектную форму 3' → 5'-корректирующей экзонуклеазы, представляющей собой субъединицу ДНК-полимеразы (см. разд. 5.3.3). Если дефект затрагивает этот белок, то ДНК-полимераза утрачивает способность эффективно осуществлять коррекцию и в ДНК накапливается много ошибок, которые при нормальной репликации были бы устранены.
Изучение тех мутантов Е. соlі, у которых имеются гены-мутаторы, выявило еще одну систему, в норме устраняющую ошибки репликации, не улавливаемые корректирующей экзонуклеазой. Эта система коррекции неправильного спаривания (mismatch proofreading sistem), называемая также системой исправления ошибок спаривания (mismatch repair system), отличается от ранее рассмотренных систем репарации ДНК тем, что она не зависит от присутствия в ДНК аномальных нуклеотидов, которые должны быть распознаны и удалены («вырезаны»). Она выявляет деформации на внешней стороне спирали, вызванные плохой пригонкой обычных, но некомплементарных оснований. Если бы эта корректирующая система просто распознавала ошибки спаривания в реплицировавшейся ДНК и удаляла без выбора один из двух неправильно спарившихся нуклеотидов, то в половине случаев она бы сама совершала ошибку, «исправляя» не новосинтезированную, а матричную цепь, так что в среднем частота ошибок оставалась бы прежней. Для эффективной коррекции система должна уметь различать неправильно спаривающиеся нуклеотиды и избирательно удалять такие нуклеотиды только из новой цепи (т.е. устранять именно ошибки репликации).
В клетках Е. coli процесс распознавания связан с метилированием определенных остатков аденина в ДНК. Метальные группы присоеди-
Рис. 5-48. Схема эксперимента, иллюстрирующего работу системы коррекции неправильного спаривания, устраняющей у бактерий ошибки репликации ДНК. Особый белковый комплекс удаляет неспаренные нуклеотиды из вновь синтезируемой цепи ДНК позади репликационной вилки, этот репарирующий комплекс узнает новую цепь ДНК по обнаруживаемым в ней неметилированным последовательностям GATC. На схеме представлены три молекулы ДНК с одной и той же «неправильной» парой нуклеотидов, но при этом в одной молекуле (А) метилированные последовательности GATC встречаются в обеих цепях, в другой молекуле (Б) таких метилированных последовательностей нет совсем, а в третьей (В) они присутствуют только в одной из цепей. Если воздействовать на эти молекулы ДНК клеточным экстрактом, содержащим корректирующий комплекс, то мы получим представленный здесь результат. Молекула ДНК в правой части рисунка воспроизводит картину, обнаруживаемую непосредственно за репликационной вилкой: нижняя цепь соответствует новой цепи, где метилирование еще не произошло.
296
няются ко всем остаткам А в последовательности GATC, но лишь спустя некоторое время после того, как А включится в новосинтезированную цепь ДНК. Новые цепи отличаются от старых тем, что только в них сразу же за репликационной вилкой могут находиться еще не метилированные последовательности GATC. Коррекция неправильного спаривания осуществляется крупным мультиферментным комплексом, сканирующим каждую из двух цепей двойной спирали ДНК. Этот комплекс удаляет только неправильно присоединенные нуклеотиды, но делает это лишь после того, как на той же цепи обнаружится и неметилированная последовательность GATC. Поэтому нуклеотиды удаляются только из новой цепи, т. е. устраняются ошибки репликации (рис. 5-48).
В эукариотических клетках не удалось пока выявить ни одного из этих двух механизмов коррекции, обнаруженных у бактерий. Однако степень точности репликации у млекопитающих и у Е. coli приблизительно одинакова, и потому можно думать, что оба описанных типа коррекции существуют и у эукариот. Следует, впрочем, отметить, что в ДНК млекопитающих нет метилированных остатков А, поэтому механизм, который используется системой репарации ошибок спаривания для узнавания новосинтезированной цепи, должен быть в данном случае иным.
5-27
5.3.9. Репликационные вилки возникают в точках начала репликации [32]
И у бактерий, и у млекопитающих образование репликационных вилок начинается с возникновения особой структуры, называемой репликационным глазком (replication bubble). Это небольшой участок, в котором две цепи родительской спирали ДНК отделились одна от другой
ибыли использованы в качестве матриц для синтеза ДНК (рис. 5-49). Для бактерий и некоторых вирусов, размножающихся в эукариотических клетках, удалось показать, что репликационный глазок образуется в тех местах молекулы ДНК, где находятся специфические нуклеотидные последовательности, получившие название точек начала репликации. Эти последовательности состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. Предполагают, что аналогичные точки начала репликации существуют и в эукариотических хромосомах, однако надежных доказательств этого пока нет (см. разд. 9.3.2).
Процесс возникновения репликационных вилок удалось в некоторых случаях воспроизвести in vitro. Эти опыты показали, что у бактерий
ибактериофагов инициация репликационных вилок начинается так, как это представлено на рис. 5-50. Множество копий инициаторного белка связываются с особыми участками в точке начала репликации, образуя крупный белковый комплекс. Этот комплекс присоединяет затем ДНКгеликазу и помещает ее на свободную одиночную цепь ДНК в прилегающем участке спирали. Присоединяется также ДНК-праймаза, т. е. образуется праймосома, которая, двигаясь от точки начала репликации, синтезирует РНК-затравку, что дает возможность начать синтез первой цепи ДНК. Остальные белки быстро объединяются после этого в два репликационных белковых комплекса, которые теперь движутся от точки начала репликации в противоположных направлениях (см. рис. 5-49); они продолжают синтезировать ДНК до тех пор, пока обе вилки не пройдут путь по матрице до самого конца.
Некоторые дополнительные данные, касающиеся инициации репликационных вилок в хромосомах эукариот, мы обсудим в гл. 9, там, где речь пойдет о клеточном ядре.
Рис. 5-49. Гипотетический механизм образования репликационных вилок в точках начала репликации (см. также рис. 5-50).
297
Рис. 5-50. Упрощенная схема, иллюстрирующая начальные этапы образования репликационных вилок в точках начала репликации у Е. соlі и бактериофага λ. Для обнаружения данного механизма потребовались опыты in vitro с использованием смеси высокоочищенных белков. Последующие этапы приводят (пока не ясным путем) к инициации еще трех цепей ДНК (рис. 5-49). У Е. соlі в репликации ДНК роль инициаторного белка играет белок dnaA; а праймосома состоит из белков dnaB (ДНК-геликаза) и dnaG (ДНК-праймаза).
5.3.10. ДНК-топоизомеразы предотвращают спутывание ДНК во время репликации [33]
Изображая спираль ДНК так, как мы это делали до сих пор, т.е. неправильно, в виде плоской «лестницы», мы игнорировали «проблему закручивания» (winding problem). Между тем на каждые 10 пар оснований, образующихся в репликационной вилке, родительская двойная спираль должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперед, вся хромосома впереди нее должна быстро вращаться (рис. 5-51), что для длинных хромосом потребовало бы большой затраты энергии. При репликации ДНК эта проблема решается иначе: путем образования в спирали своего рода «шарнира», особого класса белков, называемых ДНК-
топоизомеразами.
ДНК-топоизомераза представляет собой нечто вроде «обратимой нуклеазы». Сначала она разрывает цепь ДНК, а затем ковалентно присоединяется к разорванному концу. Ковалентная связь белок — ДНК обладает довольно значительной энергией, потому что в ней сохраняется энергия разорванной фосфодиэфирной связи. Вследствие этого реакция, приводящая к разрыву цепи, обратима и не требует дополнительной затраты энергии. В этом отношении данный механизм существенно отличается от механизма действия ДНК-лигазы, о котором мы говорили выше
(см. рис. 5-35).
Существуют различные типы ДНК-топоизомераз. Топоизомераза типа I разрывает только одну из двух цепей двойной спирали ДНК, что дает возможность двум участкам ДНК по обе стороны от разрыва
Рис. 5-51. «Проблема кручения», возникающая при репликации ДНК. Для того чтобы репликационная вилка (у бактерий) могла продвигаться вперед со скоростью 500 нуклеотидов в 1 с, родительская спираль ДНК перед вилкой должна вращаться со скоростью 50 об/с.
298
Рис. 5-52. Обратимая реакция, приводящая к появлению разрыва в одной из цепей ДНК. Реакция у эукариот катализируется ДНК-топоизомеразой типа I Ферменты этой группы образуют временную ковалентную связь с ДНК.
свободно вращаться относительно друг друга вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, которая в этом случае выполняет роль упомянутого выше «шарнира» (рис. 5-52). Всякое напряжение в спирали ДНК заставляет ее вращаться в таком направлении, чтобы ослабить это напряжение. Поэтому вращение во время
299
Рис. 5-53. Пример реакции разделения двух сцепленных кольцевых молекул ДНК, катализируемой ДНК-топоизомеразой типа II. Действие этих ферментов (в отличие от реакций, катализируемых ДНК-топоизомеразами типа I) сопряжено с гидролизом АТР и некоторые из них способны сообщать спирали ДНК дополнительное напряжение. ДНК-топоизомеразы типа II обнаруживаются и у прокариот, и у эукариот, по всей вероятности, они участвуют во многих реакциях, имеющих отношение к ДНК.
репликации ДНК происходит лишь на коротком отрезке спирали - в той части, которая находится непосредственно перед репликационной вилкой. Аналогичная проблема, возникшая в процессе транскрипции ДНК, решается таким же путем.
Топоизомераза типа II ковалентно связывается с обеими цепями двойной спирали ДНК и вносит в нее на время двухцепочечный разрыв. Ферменты этого типа активируются под действием тех участков на хромосомах, где перекрестились спирали. Присоединившись к такому перекресту, топоизомераза: 1) обратимо разрывает одну из двух двойных спиралей, создавая тем самым для другой своего рода «ворота», 2) вынуждает вторую двойную спираль пройти через этот разрыв и 3) сшивает обе разорванные цепи, а затем отделяется от ДНК. Действуя подобным образом, топоизомеразы типа II очень быстро разделяют две сцепленные кольцевые молекулы ДНК (рис. 5-53). Точно так же предотвращают они и спутывание молекул ДНК, которое в противном случае неизбежно создавало бы при репликации серьезную проблему. Известны температурочувствительные мутанты дрожжей, вырабатывающие топоизомеразу II, которая при 37°С инактивируется. Если нагреть эти дрожжевые клетки до такой температуры, то их хромосомы в процессе митоза остаются спутанными и не могут разойтись. Насколько необходим для распутывания хромосом такой «инструмент», как топоизомераза II, поймет каждый, кто хоть раз пытался распутать безнадежно запутавшуюся леску, не имея под рукой ножниц.
5-28
5.3.11. Репликация ДНК у эукариот и прокариот в основных чертах сходна [24]
Почти все, что мы знаем о репликации ДНК, удалось выяснить в опытах с очищенными мультиферментными системами бактерий и бактериофагов, способными осуществлять репликацию ДНК in vitro. Получение таких систем в 1970-х годах заметно облегчилось после того, как удалось выделить мутанты по целому ряду различных генов, ответственных за репликацию, которые можно было использовать для идентификации
иочистки соответствующих белков (рис. 5-54).
Уэукариот энзимология репликации ДНК пока еще детально не изучена, главным образом потому, что получать здесь необходимые мутантные формы гораздо труднее. Однако схема репликации у прокариот и эукариот в основных чертах, включая геометрию репликационной вилки и потребность в РНК-затравке, по-видимому, одинакова. Главное различие заключается в том, что у эукариот ДНК реплицируется не как таковая, а в виде хроматина, в котором она прочно связана с белками, принадлежащими к классу гистонов. В гл. 8 мы узнаем, что гистоны образуют комплексы в форме дисков, вокруг которых обвивается эукариотическая ДНК, в результате чего возникают регулярно повторяющиеся структуры, называемые нуклеосомами. Нуклеосомы располагаются вдоль молекулы ДНК с интервалами 200 пар оснований. Быть может, именно этим объясняется тот факт, что новые фрагменты отстающей цепи ДНК закладываются у эукариот с интервалами в 10 раз более короткими (от 100 до 200 нуклеотидов), чем у бактерий (от 1000 до 2000 нуклеотидов). Кроме того, если нуклеотиды служат барьерами, на время останавливающими продвижение ДНК-полимеразы, присутствие хроматина (а не голой ДНК) может, вероятно, объяснить и то, что репликационные вилки движутся у эукариот приблизительно в 10 раз медленнее, чем у бактерий.
300
Рис. 5-54. Получение у бактерий и бактериофагов мутантов с различными нарушениями репликации ДНК открыло возможности для выявления и очистки ферментов, выполняющих какую-либо еще не известную функцию, необходимую для репликации ДНК у прокариот. Использованные здесь температурочувствительные мутанты принадлежат к так называемым условным мутантам, обычно их фермент нормально функционирует при низкой температуре и не работает при высокой. У «безусловных» мутантов с нарушениями репликации синтез ДНК не идет ни при низкой, ни при высокой температуре, и потому эти мутанты обречены на гибель. В модифицированной форме такие «тесты на комплементацию in vitro» полезны также при биохимическом изучении многих других процессов.
Заключение
Самокорректирующая ДНК-полимераза катализирует полимеризацию нуклеотидов на обеих цепях спирали ДНК в направлении 5' → 3', копируя матрицу с высокой степенью точности. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК аптипараллелъны, в направлении 5' → 3' может непрерывно синтезироваться лишь одна из двух цепей (ее называют ведущей). Другая, отстающая цепь синтезируется в виде коротких фрагментов по принципу «шитья назад иголкой». Самокорректирующая ДНК-полимераза не способна начинать синтез новой цепи. Поэтому для закладки фрагментов отстающей цепи ДНК используются короткие молекулы РНК-затравки, которые позже удаляются - их заменяет ДНК.
Процесс репликации ДНК требует совместного действия многих белков. В нем участвуют: 1) ДНК-полимераза и ДНК-праймаза,
катали-