Молекулярная биология клетки. Том 1

192

Рис. 4-30. Кристаллы фермента гликоген-фосфорилазы при наблюдении в световой микроскоп. (С любезного разрешения Robert Fletterick.) дифракционная картина кристаллической решетки будет состоять из множества ярких пятен различной интенсивности (рис. 4-29). Относительная интенсивность различных пятен в дифракционной картине зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. В действительности интенсивность данного пятна пропорциональна интенсивности излучения, которое будет отражаться в данном направлении от характерного одиночного объекта. Таким образом, положение пятен в дифракционной картине зависит от расположения объекта в системе, а их интенсивность дает информацию о внутренней структуре типичного объекта. Более того, такая информация является точной и достаточной, поскольку она была получена путем объединения вкладов множества равноценных источников. На самом деле, пользуясь довольно полным описанием дифракционной картины такой решетки, можно зачастую вычислить структуру отдельных объектов, образующих кристаллическую решетку.

4.1.14. Дифракция рентгеновских лучей дает возможность выявить трехмерную организацию атомов в молекулах

[13]

Если для анализа молекулярной структуры предполагается использовать дифракционные картины, то излучение, претерпевающее дифракцию, должно иметь длину волны более короткую, чем расстояние между атомами в молекуле. Длина волны рентгеновских лучей около 0,1 нм (что соответствует диаметру атома водорода), и поэтому данный тип излучения идеально подходит для анализа расположения индивидуальных атомов в молекулах. Такую задачу нельзя решить даже на самых современных электронных микроскопах. Существенным преимуществом рентгеновских лучей является высокая (выше, чем у электронов) проникающая способность. Это делает пригодными для анализа более толстые образцы. И наконец, поскольку в данном случае использование вакуума не предусмотрено, можно изучать толстые водосодержащие образцы. Вследствие этого исключаются артефакты, возникающие в процессе приготовления образца.

Для достижения высокого разрешения необходимо иметь кристаллы с высокой степенью упорядоченности (рис. 4-30). По мере прохождения через образец рентгеновские лучи рассеиваются электронами атомов, составляющими образец. Поэтому большие атомы с большим количеством электронов рассеивают рентгеновские лучи более эффективно, чем небольшие атомы, так что атомы С, N, О, Р регистрируются гораздо более надежно, чем атомы Н; известно, что очень тяжелые атомы тоже рассеивают рентгеновские лучи очень эффективно. Процесс преобразования рентгенограммы в трехмерную структуру атомов, уложенных в молекулу, весьма сложен. Расшифровка рентгенограмм, образованных крупными и неупорядоченными молекулами белков, до 1960 года была невозможна (табл. 4-3). Эта процедура требует локализации и оценки интенсивности сотен тысяч пятен, равно как и фаз волн каждого пятна. В последние годы рентгеноструктурный анализ все более автоматизируется. Рассеянные рентгеновские лучи измеряются изощренными электронными детекторами, что существенно ускоряет процесс накопления данных, а мощные компьютеры выполняют множество необходимых вычислений. В настоящее время наиболее длительным этапом в подобном исследовании является этап получения подходящих кристаллов исследуемых макромолекул; зачастую на подбор оптимальных условий кристаллизации уходят годы. Но, несмотря на эти трудности, рентгеноструктурный анализ нашел широкое применение, поскольку до настоящего времени остается единственным

193

Таблица 4-3. Основные вехи в развитии метода рентгеноструктурного анализа и его применение в исследовании биологических молекул 1864 - Хоппе-Зейлер (Hoppe-Seyler) получил в кристаллическом виде гемоглобин и предложил для него название.

1895 - Рентген (Roentgen) наблюдал образование новой формы проникающей радиации при попадании катодных лучей (потока электронов) на металлическую мишень. Это излучение было названо Рентгеном Х-лучами (в русской научной литературе «рентгеновские лучи»)

1912 - фон Лауэ (Von Laue) получил первую рентгенограмму, пропуская рентгеновские лучи через кристалл сульфида цинка

1912 - В. Л. Брэгг и В. Х. Брэгг (W. L. Bragg, W. Н. Bragg) обнаружили простую взаимосвязь между характером дифракционной картины и расположением атомов в кристалле

1926 - Самнер (Sumner) получил кристаллы уреазы из экстрактов канавалии мечевидной й показал, что эти белки обладают каталитической активностью

1931 - Полинг (Pauling) опубликовал свою работу «Природа химических связей», в которой уточнил правила ковалентного связывания 1934 - Бернал и Кроуфут (Bernall, Crowfoot) представили первую подробную рентгенограмму белка, полученную для кристаллов

фермента пепсина

1935 - Паттерсон (Patterson) разработал аналитический метод определения расстояния между атомами по данным рентгеноструктурного анализа

1941 - Эстбюри (Astbury) получил первую рентгенограмму ДНК

1951 - Полинг и Кори (Pauling, Corey) обосновали существование двух основных типов укладки цепи L-аминокислот (в виде α-спирали и складчатого β-слоя), которые были позже обнаружены во многих белках

1953 - Уотсон и Крик (Watson, Crick) предложили модель двойной спирали ДНК на основе рентгенограмм, полученных Франклин и Уилкинсом (Franklin, Wilkins)

1954 - Перутц (Perutz) и сотрудники разработали метод тяжелых атомов для решения проблемы фазы в кристаллографии белка

1960 - Кендрью (Kendrew) впервые подробно описал структуру белка (миоглобина кашалота) с разрешением 0,2 нм, а Перутц (Perutz) - структуру более крупного белка - гемоглобина, но в этом случае разрешение было несколько хуже

1966 - Филлипс (Phillips) впервые подробно описал структуру белка лизоцима

1976 - Ким, Рич, Клуг (Kim, Rich, Clugh) и сотрудники, использовав данные рентгеноструктурного анализа, подробно описали структуру тРНК

1977-78 - Холмс и Клуг (Holmes, Clugh) определили структуру вируса табачной мозаики (ВТМ), а Гаррисон и Россман (Harrison, Rossman)- структуру двух сферических вирусов

методом определения детального расположения атомов в большинстве молекул. Имея хорошие кристаллы, можно рассчитать структуру белка с разрешением 0,3 нм и выявить не только основные закономерности расположения полипептидной цепи, но и некоторые более мелкие детали. Затратив значительные усилия, можно получить кристаллы высокого качества, что в свою очередь позволяет достичь разрешения 0,15 нм и определить расположение почти всех неводородных атомов в молекуле белка. Именно таким образом к настоящему времени были установлены структуры более сотни белков и нескольких малых молекул РНК и ДНК.

Заключение

Для наблюдения клеток существует множество методов световой микроскопии. Окрашенные и фиксированные клетки можно наблюдать с помощью обычной оптики. Использование флуоресцентного микроскопа

194

и меченых антител позволяет локализовать в клетках специфические молекулы. Клетки в естественном живом состоянии анализируют под фазово-контрастной, интерференционной или темнопольной оптикой. Светомикроскопические исследования живых клеток подкрепляются обработкой изображений с помощью электроники, что существенно усиливает чувствительности и увеличивает разрешение.

Определение подробной структуры мембран и органелл в клетках возможно только при высоком разрешении, которое дает просвечивающий электронный микроскоп. Просвечивающий электронный микроскоп также используют для определения формы индивидуальных макромолекул, оттененных тяжелыми металлами или негативным контрастированием. Однако точное расположение каждого атома в молекуле можно определить только после образования молекулами крупных кристаллов. В этом случае с помощью рентгеноструктурного анализа может быть рассчитана полная трехмерная структура молекулы.

4.2. Изучение химической среды в живых клетках

Классические методы микроскопии позволяют судить о клеточной архитектуре, но не дают подробной информации о клеточной химии. Мы уже говорили о том, что для локализации в клетках специфических макромолекул можно использовать антитела. Но столь же важно знать распределение и концентрацию малых молекул. Поддержание жизни возможно только при быстрой и точной регуляции концентрации таких важнейших метаболитов, как АТР, глюкоза и неорганические ионы; содержание этих веществ в различных участках клеток и тканей может существенно варьировать. Более того, поскольку низкомолекулярные вещества, такие, как клеточный АТР, кальций и водород могут выполнять функцию внутриклеточных «мессенджеров», очень важно уметь прослеживать изменение их концентрации в ответ на внутриклеточные сигналы. В этом разделе мы будем обсуждать некоторые методы, заимствованные из химии, методы, которые позволяют определять химические условия в клетках в процессе их жизнедеятельности.

4.2.1. Для определения химических условий в популяции живых клеток можно использовать ядерный магнитный резонанс (ЯМР) [14]

Ядра многих атомов характеризуются магнитным моментом: следовательно, они, подобно магнитным стрелкам, обладают внутренним магнетизмом. Магнитные характеристики этих атомов подвержены влиянию со стороны окружающих атомов. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), являющийся безвредным для живых клеток, позволяет определить химическую природу вещества. Если ядра атомов, обладающие магнитным моментом, поместить в магнитное поле, они принимают одну из возможных ориентации. Каждая из ориентации характеризуется энергией, определяемой силой поля и химическим окружением. При облучении радиоволнами набора атомов в идентичном химическом окружении, энергия этих волн будет в значительной степени абсорбироваться, если волны обладают строго определенной частотой, соответствующей разности энергетических состояний двух возможных ориентации ядер в магнитном поле. Это так называемая резонансная частота. Образец ткани содержит атомы в различных молекулах и в различном окружении и будет поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. Такой

195

спектр отражает структуру и относительное содержание каждого типа молекул, содержащих магнитные ядра.

В химических лабораториях ЯМР широко используется как аналитическая методика для определения структуры малых молекул в растворах. Совершенствование приборного парка сделало возможным применение метода ЯМР для изучения биологических объектов. Например, сигнал ЯМР, исходящий от протонов (ядер водорода), часто используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул в растворе: взаимодействие частей макромолекулы влияет на спектр ЯМР, и поэтому спектр ЯМР содержит подробную информацию о молекулярной структуре и молекулярных движениях. В отличие от рентгеноскопии ЯМР не требует кристаллизации образцов. Однако для создания содержательного спектра ЯМР молекулы в растворах должны быстро «кувыркаться». Этим и объясняется существование верхнего предела (около 20 тыс. дальтон), ограничивающего размеры макромолекул, конформация которых может подвергаться эффективному анализу.

Лишь некоторые атомы имеют изотопы, создающие удовлетворительный сигнал ЯМР. Для изучения макромолекул, содержащихся внутри живой клетки, обычно используют широко распространенные

Рис. 4-31. Спектр ЯМР 31Р, записанный с мышцы лягушки (А -в расслабленном состоянии, Б после 15 мин стимулируемой активности в анаэробных условиях, В после 50 мин такой активности). Пять меченых пиков на спектре представляют сигналы от ядер Р, находящихся в различных атомах:

один пик соответствует фосфокреатину, α, β и γ -трем фосфатным группам АТР и PI - неорганическому фосфату. В расслабленной мышце фосфокреатин содержится в высокой концентрации (А); он выполняет функцию депо свободной энергии в скелетных мышцах, поскольку его фосфат прямо переносится на ADP для восстановления АТР, гидролизуемого в процессе мышечного сокращения. Следовательно, в уставшей мышце депо фосфокреатина снижается, а концентрация неорганического фосфата (образующегося из АТР) соответственно возрастает. Пик Рi также слегка смещается влево, отражая изменение клеточного рН за счет накопления молочной кислоты - побочного продукта анаэробного метаболизма. По расположению пика Pi, сравниваемого с таковым для известного стандарта, можно рассчитать, что в данном случае рН изменился от 7,5 (А) до

6,4 (В). (Изменено с разрешения M.J. Dowson, D. J. Gedian, D.R. Wilkie, Nature, 274, 861-866, 1978. Copyright 1978 McMillan Magazine Ltd.)

196

изотопы 1Н, 23Na, 31P, 39K и редкие изотопы 13Cu15N. Ввиду важной роли соединений фосфора, которую они играют в метаболизме, эффективным оказывается определение ЯМР 13Р. Этот изотоп в норме присутствует в фосфорсодержащих веществах клеток. Сигналы, создаваемые им, можно использовать для слежения за изменением внутриклеточной концентрации в процессе мышечного сокращения таких соединений, как АТР и неорганический фосфат. Сигналы ЯМР от изотопа фосфора 31Р полезны также для точного измерения внутриклеточного рН, поскольку резонансная частота неорганического фосфата определяется состоянием его ионизации и, следовательно, рН раствора (рис. 4-31).

Редкие изотопы 13С и 15N в норме не содержатся в клетках в достаточных количествах, однако их можно вводить в специфические макромолекулы, имеющие биологическое значение. С помощью ЯМР удается следить впоследствии за их химической трансформацией. Если, например, выращивать клетки на среде с глюкозой 13С, то, измеряя в течение некоторого времени спектр ЯМР образца, можно определять скорость многих реакций, в которых участвует глюкоза. Используя другие меченные 13С и 15N соединения, можно в принципе следить за перемещением атомов углерода и азота по любым метаболическим путям.

Основным ограничением метода ЯМР является его низкая чувствительность. Например, для определения содержания какого-либо соединения с использованием современных модификаций метода 31Р-ЯМР, в грамме живой ткани должно содержаться не менее 0,2 мМ исследуемого соединения. Однако многие метаболиты присутствуют в живых тканях в более низких концентрациях. Более того, поскольку для снятия одного спектра ЯМР требуется, как правило, несколько минут, можно не уловить быстрые изменения цитохимических характеристик. С другой стороны, значительное преимущество ЯМР состоит в его безвредности для живых клеток, и это обстоятельство делает данный метод весьма перспективным для клеточной биологии.

4.2.2. Концентрацию ионов можно измерять внутриклеточными электродами [15]

Для изучения отдельных клеток необходимо использовать методы более чувствительные, чем ЯМР. Один из них основан на подходе, разработанном электрофизиологами для изучения разности потенциалов и тока на плазматической мембране. С этой целью готовят внутриклеточные микроэлектроды. Они состоят из тонких стеклянных трубок, диаметр конца которых измеряется долями микрона; такие трубочки заполняют электропроводным раствором (обычно это раствор соли КС1 в воде). Кончик микроэлектрода вводят в цитоплазму через плазматическую мембрану, которая смыкается вокруг капилляра, плотно прилегая к стеклу, так что клетка остается относительно неповрежденной.

В исследовании клеточного содержимого микроэлектроды используют двояко: с их помощью можно измерять внутриклеточную концентрацию обычных ионов, таких, как ионы Н+, Na+, K+, С1-, Са2+-и Mg2+ . Они могут быть использованы и для инъекции молекул в клетки. Принцип измерения концентрации ионов микроэлектродом тот же, что и в рН-метре. Стремление ионов диффундировать по градиенту концентрации может быть уравновешено приложением электрического поля противоположной направленности: чем выше градиент концентрации, тем выше значение электрического поля. Величина электри-

198

Рис. 4-34. Четыре стандартных варианта «пэтч»-регистрации. Отверстие стеклянной регистрирующей пипетки сперва прижимают к клеточной мембране, создавая плотный контакт (вверху). Величину тока проходящего через пипетку в данном участке мембраны можно определить, если участок мембраны сохраняет контакт с клеткой (А); участок мембраны отделен от клетки и цитоплазматическая поверхность этого участка обнажена (6); мембрана разрушена при мягком всасывании и электрод напрямую сообщается с внутренним содержимым клетки. Вариант, представленный в правой части рисунка (Г), позволяет регистрировать электрические характеристики клетки, как при использовании внутриклеточного электрода. В данном случае можно изменить химические условия в клетке за счет введения определенных веществ, диффундирующих в цитоплазму через сравнительно толстую регистрирующую пипетку. Конфигурация Г возникает из конфигурации 5, когда пипетка отделяется от клетки и соприкасающийся с электродом участок мембраны как бы затыкает пипетку. В случае Г с электродом, как правило, соприкасается не цитоплазматическая, а наружная поверхность мембраны (сравните с Б).

ионы Са2+ , показания таких электродов зачастую оказываются ошибочными. Между тем изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ очень важно учитывать при изучении реакции клеток на внеклеточные сигналы. Такие изменения можно анализировать, используя внутриклеточные индикаторы, излучающие свет. Некоторые из этих индикаторов по своей природе являются люминесцентными (излучающими свет спонтанно), другие флуоресцентными (излучающими свет в ответ на возбуждение светом). Так, например, люминесцентный белок экварин, выделяемый из морской медузы, излучает свет в присутствии Са2+ и реагирует на изменение концентрации Са2+ в пределах от 0,5-10 мкМ. Если акварин инъецировать в яйцеклетку, а затем ее оплодотворить, в цитоплазме происходит изменение концентрации Са2+, регистрируемое по вспышке света, который излучает экварин (рис. 4-35). Недавно были синтезированы флуоресцентные индикаторы, прочно связывающиеся с Са2 + . Показано, что в свободном состоянии они излучают свет большей длины волны нежели связанная форма. Измеряя изменение интенсивности флуоресценции при двух длинах волн, излучаемых этим индикатором, можно определить соотношение свободной и Са-связанной фракций индикатора; благодаря этому можно точно оценить концентрацию свободных ионов Са2+ . Два известных индикатора такого типа - квин-2 и фура-2 - используют для постоянного наблюдения за изменениями внутриклеточной концентрации Са2+ в различных участках клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Подобные внутриклеточные индикаторы созданы для измерения внутриклеточного рН. Некоторые из них проникают в клетки за счет диффузии и их не нужно микроинъецировать; в этом случае можно под флуоресцентным микроскопом одновременно наблюдать значительное количество отдельных клеток. Создание новых типов внутриклеточных индикаторов и их использование в комплексе с современными спо-

199

Рис. 4-35. Флуоресцирующий белок, акварин, излучает свет в присутствии свободных ионов Са++. В икринку рыбы вводили экварин, диффундировавший через цитозоль. Затем проводили искусственное оплодотворение и наблюдали за яйцом, применив метод усиления изображения. Были сделаны четыре фотоснимка со стороны точки проникновения спермия; интервал 10 с. Обнаружено появление в цитозоле волны ионов Са+ , высвобождающихся из внутренних депо, которые расположены непосредственно под клеточной мембраной. Начиная от места проникновения спермия, эта волна проходит через все яйцо, как указано на диаграмме слева. (Фотографии воспроизводятся из J. С. Jinkey, L. F. Jafle, Е. В. Ridge-way, J.T. Reynolds J. Cell Biol., 76, 448-476, 1978 Copyright Rockefeller University Press.)

Рис. 4-36. Микрофотографии участка раннего эмбриона Drosophila, который инъецирован тубулином, предварительно меченным родамином (тубулин - белок микротрубочек). На этой ранней стадии развития ядра объединены общей цитоплазмой, и поэтому микротрубочки метятся во всем эмбрионе. А. Микротрубочки в живом эмбрионе исходят из двух ярких пятен по обе стороны от каждого из интерфазных ядер; в центре каждого пятна центросома. Б. Этот же эмбрион через несколько минут, когда все ядра синхронно входят в митоз. Микротрубочки сохраняют контакт с центросомами, но они подверглись реорганизации и сформировали митотическое веретено. (С любезного разрешения Douglas Kel-

собами обработки изображения позволяет разработать быстрые и точные методы измерения внутриклеточной концентрации многих низкомолекулярных веществ.

4.2.4. Существует несколько методов для введения в клетки молекул, не проникающих через мембрану [17]

Иногда возникает потребность введения в клетки молекул, не проникающих через мембрану. Это могут быть светоизлучающие индикаторы (как акварин), клеточные белки, связанные с флуоресцентной меткой, молекулы, которые оказывают влияние на поведение клеток. Один из подходов состоит в микроинъекции молекул в клетки с помощью стеклянной микропипетки. Это очень эффективная методика, сущность которой состоит в следующем: очищенный белок связывается с флуоресцентной меткой и затем его инъецируют в клетки. Используя соответствующий микроскоп, исследователь получает возможность следить за поведением такого белка в процессе роста и деления клеток (рис. 4- 36).

Микроинъекции - весьма эффективный и достаточно широко используемый метод, однако важно помнить, что в данном случае процедуре микроинъекции подвергается каждая клетка отдельно, поэтому количество клеток, которые можно наблюдать одновременно, ограничено. Существуют методы, позволяющие одновременно повышать проницаемость клеточных мембран у множества клеток, составляющих клеточные популяции. Для этого используют мощный электрический разряд или химическое воздействие, например, раствором детергента

200

Рис. 4-37. Для внутриклеточного введения веществ, не проникающих через клеточную мембрану, используют три метода. А. Вещество в клетку вводят с помощью микропипетки за счет гидравлического давления поршня или электрического заряда вводимых молекул, вследствие чего вещество проникает в клетку в виде потока ионов (метод ионофореза). Б. Клеточная мембрана под действием короткого и мощного электрического разряда (2000 в/см в течение 200 мкс) нарушается, что обеспечивает вхождение в клетку определенных веществ. В. Использовано слияние мембран. В начале процедуры получают пузырьки, окруженные мембранами (липосомы). Затем липосомы загружают необходимым веществом, смешивая концентрированный раствор этого вещества и суспензию фосфолипидов. Другая модификация этого метода включает на первом этапе нарушение мембраны эритроцитов, приводящее к утрате ими клеточного содержимого, и последующее помещение полученных «теней эритроцитов» в раствор нужного вещества, где происходит их заполнение и затягивание плазматических мембран. Оба вида носителей (как липосомы, так и «тени эритроцитов») можно вводить в клетки-мишени за счет слияния мембран под действием определенных вирусных белков (синтезируемых вирусом для облегчения проникновения в клетки).

низкой концентрации. Электрический разряд создает в плазматической мембране большие поры без повреждения внутриклеточных мембран. Эти поры остаются открытыми в течение нескольких минут и даже часов в зависимости от типа клеток и интенсивности электрического воздействия. Через эти поры даже макромолекулы могут быстро входить в цитозоль или покидать его. При ограниченном воздействии мембрана у значительной части клеток восстанавливается и клетки выживают. Третий метод введения в клетки крупных молекул состоит в слиянии частиц, окруженных мембраной и содержащих необходимые молекулы, с плазматической мембраной клетки. Все три метода широко применяются в клеточной биологии (рис. 4-37).