Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_1449_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
271
рабочий диапазон длин волн – 350-1000 нм (FLAMET-VIS-NIR-ES, Ocean
Optics, США). Передача и сбор оптического излучения осуществляется с
помощью оптоволоконных зондов малого диаметра, позволяющего вводить
его в стандартные медицинские иглы или дренажные системы. Свет от
источников через тонкоигольный оптоволоконный зонд идет к
биологическому объекту, отражается или переизлучается в форме
флуоресценции, собирается оптическим волокном и поступает на
спроектированный рефокусатор, который состоит из двух коллиматоров,
между которыми помещены эмиссионные фильтры (ООО «НТЦ Волоконно-
Оптических Устройств»). Эмиссионные светофильтры устанавливаются в
оптический тракт измерительных каналов автоматически и предназначены для
ослабления обратно отражённого излучения источников монохроматического
светового излучения в канале ФС – FGL400 и FGL495 (Thorlabs, Inc., USA) с
длинами волн среза 400 нм и 495 нм, соответственно. Связь пользователя с
блоком управления осуществляется через специализированную
разработанную программу, установленную на персональный компьютер.
Программный модуль предназначен для управления мультимодальной
установкой, позволяющей реализовать регистрацию данных методами
спектроскопии диффузного отражения и флуоресцентной спектроскопии, с
возможностью предварительной математической обработки и дальнейшего
экспорта данных в формате .txt. [499]. Язык программирования: Python.
В зависимости от поставленных медицинских задач могут
использоваться оптоволоконные зонды различных диаметров (глава 5.2).
Внешний вид рабочего макета ПАК и набор тонкоигольных
оптоволоконных зондов показаны на рисунке 5.8а. Управление комплексом
осуществляется при помощи графического интерфейса (рисунок 5.8б).
Интерфейс включает в себя следующие элементы: индикаторы поочередной
работы источников излучения, визуализацию спектров диффузного отражения
и флуоресценции, возбужденной на длинах волн 365 и 450 нм, рассчитанное
значение тканевой сатурации и амплитуд флуоресценции A
F365
и A
F450
.
272
а)
б)
Рисунок 5.8 – Вид рабочего макета ПАК флуоресцентно-отражательной
спектроскопии для интраоперационной ОД во время проведения дренажных
и пункционных МИХВ (а) и интерфейс управления (б)
В случае, когда комплекс используется для навигации кончика иглы при
ЧПБ печени, на экран выводится значение вероятности отнесения
биологической ткани к классам «паренхима печени» или «опухоль печени».
При использовании комплекса в диагностике состояния печени у пациентов с
МЖ на экран выводится вероятность отнесения пациента к классу
«неблагоприятный прогноз послеоперационного течения заболевания».
Для регистрации спектров диффузного отражения предварительно
проводится начальная калибровка. Спектры отражения вычисляются по
следующей формуле:
)()(
)()(
)(
bPTFE
bt
RR
RR
R
−
−
=
(5.2)
где
)(
t
R
– измеренный коэффициент диффузного отражения (КДО)
биологической ткани;
)(
PTFE
R
– измеренный КДО эталона диффузного отражения WS-1;
)(
b
R
– фоновый спектр, полученный при выключенном источнике света.
273
Данное нормирование позволяет исключить влияние на измерения
спектральных зависимостей интенсивности излучения источника и
чувствительности приемника.
Для контроля возможности регистрации комплексом изменений
перфузионно-метаболических параметров в биологических тканях проведены
экспериментальные измерения интенсивности флуоресценции основных
эндогенных флуорофоров в разной концентрации. Измерения флуоресценции
включали в себя регистрацию спектров в капле объемом 10 мкл вещества с
заранее известными свойствами, приготовленного непосредственно перед
измерениями и нанесенного на фольгу, не обладающую автофлуоресценцией.
Список исследуемых флуорофоров, протоколы приготовления рабочих
растворов и их концентрации приведены в таблице 5.3.
Таблица 5.3 – Флуорофоры для тестирования комплекса
№
Флуорофор
Приготовление
Концентрации,
мМ
1
2
3
4
1
НАДН
[75,239,466,500–
503]
Приготовление раствора из сухого вещества
(Sigma-Aldrich, США).
Растворитель – 10 мМ трис-HCl (рН 8,5).
Стоковый раствор: 5 мМ.
Растворы рабочих концентраций готовятся
путем разбавления стокового растворителем до
99,5% необходимого объема. Непосредственно
перед измерением в исследуемый раствор
вносится свежеприготовленный 1 М раствор
дитионита натрия (восстановителя) в
количестве 0,5 % от необходимого объема.
0,001
0,01
0,05
0,1
1
2
ФАД
[239,466,501,502
,504]
Приготовление раствора из сухого вещества
(Sigma-Aldrich, США).
Растворитель – фосфатно-солевой буфер
(phosphate buffered saline, PBS). Стоковый
раствор: 5 мМ. Растворы рабочих
концентраций готовятся путем разбавления
стокового растворителем до необходимого
объема.
0,001
0,01
0,05
0,1
0,5
1
274
Продолжение таблицы 5.3
1
2
3
4
3
Протопорфирин
IX
[187,466,501,502
,505]
Приготовление раствора из сухого вещества
(Sigma-Aldrich, США).
Растворитель – диметилсульфоксид (ДМСО).
Стоковый раствор: 5 мМ. Растворы рабочих
концентраций готовятся путем разбавления
стокового PBS до необходимого объема.
0,001
0,01
0,05
0,1
0,3
4
Билирубин
[466,501,506,507
]
Приготовление раствора из сухого вещества
(Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Индия).
Растворитель – ДМСО. Стоковый раствор: 15
мМ. Рабочие растворы с заданной
концентрацией билирубина готовятся путем
внесения стокового раствора в раствор бычьего
сывороточного альбумина (БСА) с
концентрацией 100 мкМ.
0,01
0,05
0,1
0,5
1
Концентрации были подобраны, исходя из соответствия содержанию в
биологических тканях и ранее проводимых калибровок других устройств
регистрации флуоресценции [504,508].
Результаты измерения спектров флуоресценции для длины волны
возбуждения 365 нм с помощью канала ФС ПАК приведены на рисунке 5.9.
Для флуоресценции НАДН был замечен резкий подъем при росте
концентрации до 1 мМ, в случае ФАД отмечалось более постепенное
повышение интенсивности сигнала и выход на плато для концентраций от
0,5 мМ и выше. Аналогичная динамика наблюдалась для спектров
флуоресценции протопорфирина IX. При измерении флуоресценции
билирубина наблюдалась динамика увеличения сигнала, но на самой высокой
концентрации было отмечено значительное снижение до уровня ниже, чем для
раствора с концентрацией 0,01 мМ. Такое изменение может быть обусловлено
тем, что при более высокой концентрации начинает преобладать поглощение
излучения в диапазоне 350-500 нм, что приводит к снижению сигнала
флуоресценции.
275
а)
б)
в)
г)
Рисунок 5.9 – Зависимость максимальной интенсивности флуоресценции от
концентрации раствора НАДН (а), ФАД (б), протопорфирина IX (в),
билирубина (г) при возбуждении на длине волны 365 нм
Результаты измерения спектров флуоресценции для длины волны
возбуждения 450 нм с помощью канала ФС ПАК флуоресцентно-
отражательной спектроскопии приведены на рисунке 5.10. Аналогично
спектрам для источника излучения 365 нм наблюдалось повышение
интенсивности флуоресценции ФАД до определенного уровня. Спектры
флуоресценции растворов билирубина демонстрируют более высокие
значения флуоресценции, что ожидаемо для возбуждения на длине волны 450
нм, а также аналогичную динамику на более высоких концентрациях.
276
а)
б)
Рисунок 5.10 – Зависимость максимальной интенсивности флуоресценции от
концентрации раствора ФАД (а) и билирубина (б) при возбуждении на длине
волны 450 нм
Таким образом показано, что ПАК является чувствительной системой к
изменению концентрации флуорофоров. В области, соответствующих
наиболее вероятным биологическим концентрациям НАДН 0,001-0,9 мМ
[508,509], ФАД 0,001-0,8 мМ [510,511], протопорфирин 0,001-0,015 мМ,
билирубин 0,01-0,4 мМ [512] (на рисунках 5.9-5.10 отмечены серым),
изменения являются однозначными. При концентрациях билирубина 0,3 мМ
наблюдается эффект гашения концентрации (concentration quenching). Если
концентрации достаточно высоки, интенсивность флуоресценции будет
снижаться из-за эффекта внутреннего фильтра. Этот эффект обусловлен
поглощением возбуждающего света самим образцом [513].
Апробация ПАК в преклинических и клинических условиях для
применения в пункционной и дренирующей МИХ описана в главах 3.1, 4.2 и
4.3. Подготовлена эксплуатационная документация ПАК, состоящая из
паспорта, руководства оператора и руководства программиста.
277
5.5 Программно-аппаратный комплекс флуоресцентной спектроскопии с
временным разрешением для интраоперационной оптической
диагностики во время проведения миниинвазивных хирургических
вмешательств
Далее с учетом проведенных исследований и разработанных медико-
технических требований была предложена функциональная схема ПАК ФС с
временным разрешением для интраоперационной ОД тканевого метаболизма
во время проведения МИХВ (рисунок 5.11).
Рисунок 5.11 – Функциональная схема ПАК ФС с временным разрешением
для интраоперационной ОД тканевого метаболизма
Для регистрации параметров интенсивности и времени жизни
флуоресценции комплекс реализует метод время-коррелированного счета
одиночных фотонов и построен на базе платы счета фотонов SPC-130-EMN
(Becker&Hickl, Германия). Для возбуждения флуоресценции используется
лазерный источник BDS-SM-375-FBC-101 (Becker & Hickl, GmbH, Германия),
с пиком излучения на длине волны 375 нм и частотой повторения импульсов
80 МГц, подключенный через коллиматор RC04SMA-F01 (Thorlabs, Inc.,
278
США) к монохроматору MonoScan2000 (Ocean Optics, Inc., США). В качестве
детектора используется гибридный фотодетектор HPM-100-40-CMOUNT
(Becker&Hickl, Германия) со спектральным диапазоном чувствительности
250-720 нм и квантовой эффективностью в 40 % (для 450 нм). Для выделения
участка спектра флуоресценции применяется полосовой светофильтр MF445
(Thorlabs, Inc., США), обеспечивающий детектирование флуоресценции в
диапазоне 445±45 нм. Связь пользователя с блоком управления
осуществляется через специализированную разработанную программу,
установленную на ПК.
Поскольку в экспериментальной установке используется УФ-лазер с
длиной волны 375 нм, есть высокая вероятность того, что он вызовет
возбуждение флуоресценции коферментов НАДH и ФАД. Чтобы убедиться,
что использование фильтра MF445 с полосой пропускания 445±45 нм
эффективно блокирует эмиссию кофермента ФАД, были записаны кривые
затухания флуоресценции свежих растворов НАДH и ФАД (Sigma-Aldrich,
США) с концентрациями, соответствующими их возможным значениям в
живой клетке (150 мкМ).
На рисунке 5.12 показаны характерные кривые затухания
флуоресценции, измеренные на контрольных растворах НАДH и ФАД с
использованием обоих фильтров при мощности излучения УФ-лазера на торце
тонкоигольного зонда 70 мВт. Полученные данные показывают, что сигнал,
записанный с раствора ФАД при использовании фильтра MF445, имел слабую
интенсивность с высоким уровнем фонового шума и был почти в 20 раз ниже
сигнала от НАДH. Измерения НАДH, обработанные с помощью модели
одноэкспоненциальной подгонки, также позволили оценить соответствующее
время жизни τ
NADH
= 420 пс, что соответствует литературным данным [514].
279
а)
б)
Рисунок 5.12 – Результат калибровочных измерений, показывающих
одноэкспоненциальное затухание флуоресценции калибровочных
свежеприготовленных растворов НАДH (а) и ФАД (б)
Таким образом, проведенные предварительные тесты и калибровка
позволили сделать предположение, что при использовании для сбора данных
фильтра MF445 в основном регистрируются метаболические изменения
содержания НАДH.
Дополнительно были проведены измерения, в результате которых
показано, что изменение концентрации кофермента НАДН влияет на
интенсивность флуоресценции (рисунок 5.13а), но в области физиологических
концентраций практически не влияет на параметр времени жизни (рисунок
5.13б), который как известно, зависит от связывания кофактора с белками.
а)
б)
Рисунок 5.13 – Влияние концентрации НАДН на параметры интенсивности и
времени жизни кофермента
280
В зависимости от поставленных медицинских задач ПАК может
комплектоваться оптоволоконными зондами различных диаметров и
назначения (глава 5.2). Внешний вид рабочего макета ПАК и его
расположение в операционной приведены на рисунке 3.13 главы 3.2.2.
Управление комплексом осуществляется с помощью специального ПО
SPCImage NG Data Analysis Software (Becker & Hickl, Германия),
позволяющего регистрировать и вычислять параметры времени жизни
флуоресценции (рисунок 5.14).
ксе
Рисунок 5.14 – Программное обеспечение (Becker & Hickl, GmbH, Германия)
управления ПАК для интраоперационной ОД тканевого метаболизма
Дополнительно разработан программный модуль для классификации
опухолей во время проведения ЧПБ печени [515]. Программа проводит
последовательную обработку данных с помощью МО. На экран оператора
последовательно выводятся данные для навигации кончика иглы при ЧПБ
печени – значение вероятности отнесения биологической ткани к классам
«паренхима печени» или «опухоль печени», затем значение вероятности
отнесения опухоли к одному из трех классов: первичный рак печени (ГЦК),
доброкачественная опухоль, метастазы. Для согласования стандартной
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана