Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_1449_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
161
а)
б)
в)
Рисунок 3.3 – Примеры зарегистрированных спектров флуоресценции при
возбуждении на длинах волн 365 нм (а) и 450 нм (б), а также спектров
диффузного отражения (в)
Наблюдаемые различия в спектрах ФС могут быть обусловлены
изменениями в содержании коферментов НАДН и ФАД, а также коллагена. На
рисунке 3.3 показано, что значительные различия между спектрами
диффузного отражения здоровой и опухолевой тканей наблюдаются в
диапазоне длин волн 400-600 нм. Интересным является отсутствие пиков
поглощения оксигемоглобина в спектрах, зарегистрированных в области
онкологии, что косвенно может свидетельствовать о тканевой ишемии.
Следующий этап преклинических экспериментальных исследований для
предварительной оценки возможностей разработанной мультимодальной
системы с тонкоигольным оптоволоконным зондом по дифференциации
злокачественной ткани и неизмененной паренхимы печени проводился на
лабораторных мышах. Экспериментальная модель представляла собой
гибридную мышь BDF (C57Bl6xDBA). Шесть мышей (самцы) с перевитыми
опухолями печени (штамм ГЦК H33 в правую часть средней доли печени – 100
мкл, 50 тыс. клеток) были предоставлены НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина
(Москва, Россия). Процедура перевивания раковых клеток на животных
разработана и сертифицирована данным исследовательским центром [424].
Классическая процедура ЧПБ не выполнялась в данных исследованиях из-за
сложности инструментального визуального контроля положения иглы в теле
162
небольшого лабораторного животного. Использовалась процедура
лапаротомии. Каждое животное закреплялось на специальной платформе в
положении на спине. Затем выполнялась лапаротомия, пункция паренхимы
печени и новообразования с помощью тонкоигольного оптоволоконного зонда
с регистрацией in vivo спектров ФС и СДО и последующей стандартной
процедурой взятия биоптата опухоли печени. Регистрация оптических
сигналов (20 спектров флуоресценции для каждого источника возбуждения,
100 спектров диффузного отражения) была проведена в нескольких областях
условно здоровой паренхимы печени и в опухоли (рисунок 3.4).
Рисунок 3.4 – Регистрация оптических сигналов в перевитой опухоли печени
мыши
Было обнаружено, что зарегистрированные спектры флуоресценции
обладают большой вариабельностью амплитуд (рисунок 3.5). В
регистрируемый сигнал вносят вклад большое количество флуорофоров
печени, в том числе коферменты окислительного метаболизма НАДН и ФАД,
билирубин, липофусцин и др. Еще одной особенностью было наличие пика
флуоресценции порфирина в диапазоне 635-640 нм, который вероятнее всего
связан с активным развитием опухоли [115], т.к. ряд исследователей отмечает,
что клетки злокачественных тканей проявляют тенденцию к более активному
синтезу и накоплению порфиринов, в частности протопорфирина IX [425].
163
а)
б)
в)
г)
Рисунок 3.5 – Усредненные спектры флуоресценции, полученные в
эксперименте с лабораторными мышами с перевитой опухолью печени на
длинах волн возбуждения: (а) 365 нм и (б) 450 нм; (в) усредненные спектры
диффузного отражения; (г) сравнение рассчитанных параметров между
опухолевыми (красный цвет) и условно здоровыми (синий цвет) тканями.
* – статистическая значимость различий значений подтверждена при p < 0,05
с помощью критерия Манна-Уитни
Было обнаружено, что существуют значительные различия между
формами спектров диффузного отражения нормальных и опухолевых тканей,
особенно в диапазоне длин волн 600-800 нм. Степень насыщения кислородом
крови рассчитывалась с помощью подхода, описанного в [408],
заключающегося в использовании МО и обучающих наборов данных,
полученных с помощью Монте-Карло моделирования.
Были обнаружены статистически значимые различия в содержании
кислорода между двумя типами тканей, при этом насыщенность кислородом
опухолевых тканей выше, чем в условно здоровых тканях печени. Это может
быть связано с различным типом кровоснабжения опухолей
164
(преимущественно артериальной кровью) и печени (преимущественно
венозной кровью из портальной вены).
На основе этих результатов были сделаны выводы о том, что оптическая
биопсия является перспективным инструментом для обнаружения опухолевых
клеток и были начаты клинические исследования.
3.1.2 Методика проведения клинических исследований, реализующих
регистрацию спектров флуоресценции и диффузного отражения
интраоперационно через тонкоигольный оптоволоконный зонд во время
проведения чрескожной пункционной биопсии печени
Клинические исследования проводились на базе отделения
рентгенохирургических методов диагностики и лечения БУЗ Орловской
области «Орловская областная клиническая больница» (г. Орел). Все
исследования были проведены в соответствии с принципами биомедицинской
этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее
последующих обновлениях, и одобрены локальным биоэтическим комитетом
ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени И. С.
Тургенева» (протокол № 14 от 24.01.2019 г.) (г. Орел). В группу включения
вошли пациенты с подозрением на злокачественное новообразование печени
и имеющие показания к плановой ЧПБ печени. Из исследования были
исключены пациенты с тяжелой коагулопатией, когнитивным дефицитом,
психическими состояниями и различными острыми декомпенсированными
заболеваниями.
Клиническое исследование проводилось в соответствии с
утвержденным протоколом [426]. После получения и ознакомления с
описанием протокола пациенты подписывали информированное согласие,
подтверждающее их добровольное желание участвовать в исследовании.
Измерения были выполнены в ходе стандартной процедуры ЧПБ печени у 20
пациентов с предполагаемой онкопатологией печени. Средний возраст
165
пациентов составлял 66 лет (в диапазоне от 45 до 78 лет). Десять участников
(50%) были мужчинами и десять (50%) женщинами.
На рисунке 3.6 показан процесс регистрации спектров под
ультразвуковым контролем по ходу движения иглы к патологическому очагу.
б)
а)
в)
Рисунок 3.6 – Проведение оптической биопсии печени (a) схема проведения
оптической биопсии во время стандартной операции ЧПБ печени (зонд –
тонкоигольный оптоволоконный зонд). Позиционирование зонда под УЗ
контролем: (б) в ткани печени и (в) в опухоли
Пункционное МИХВ проводилось после надлежащей дезинфекции
кожи и введения местного анестетика (2% раствор лидокаина гидрохлорида).
Спектры в неизмененной паренхиме печени регистрировались по ходу
движения пункционной иглы к месту взятия биопсийного материала из
опухоли. Использовались иглы типа Chiba 17,5 G. Для регистрации спектров в
зоне интереса (паренхима печени или опухоль) хирург вынимал стилет из иглы
166
и вводил оптоволоконный зонд.
Время экспозиции для измерения одного спектра ФС составляло 1,5 с,
спектра СДО – 0,05 с. Общее время оптических измерений составило менее
5 мин. Для каждой точки интереса было зарегистрировано 20 спектров
флуоресценции и 100 спектров диффузного отражения. После этого с
помощью той же иглы был выполнен забор материала для гистологического и
цитологического исследований.
Образцы опухолевой ткани фиксировали 10% раствором нейтрального
формалина, обезвоживали и помещали в парафин. Срезы толщиной около
5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии со
стандартными процедурами. Полученные срезы тканей были исследованы
опытным патоморфологом с помощью световой микроскопии. По результатам
гистопатологического исследования биоптатов было выявлено 20
злокачественных новообразований, из которых 18 были классифицированы
как метастазы из различных органов. Окончательный диагноз был поставлен
на основании гистопатологии, цитологии, МРТ/КТ и исследования
сывороточных онкомаркеров (альфа-фетопротеин, АФП).
3.1.3 Анализ результатов клинических исследований
При анализе амплитуд спектров флуоресценции (рисунок 3.7а, б) было
отмечено, что на обеих длинах волн возбуждения пики флуоресценции
опухолевой ткани отличаются от пиков неизмененной паренхимы печени, для
которой характерно смещение длины волны спектров в длинноволновую
область. Возможно, это связано с тем, что здоровые ткани печени содержат
более чем в 5 раз больше желчи, чем опухоли. В норме ткань печени в
основном состоит из гепатоцитов, что обеспечивает равномерное
распределение желчи. При опухолевых трансформациях эта структура
теряется. В случае метастатического поражения опухоль состоит из
аномальных клеток размножающихся тканей, встроенных в строму. Поэтому
167
желчи в опухолевых клетках метастатического происхождения практически
нет. При этом флуоресценция желчного пигмента – билирубина – может
сместить весь спектр флуоресценции печени вправо. Этот параметр может
служить диагностическим параметром для дифференциации типа ткани.
а)
б)
в)
Рисунок 3.7 – Примеры спектров флуоресценции при длинах волн
возбуждения 365 нм (а) и 450 нм (б) и спектров диффузного отражения (в),
зарегистрированных в условно здоровой паренхиме печени и в опухолевом
новообразовании
Было обнаружено, что спектры диффузного отражения паренхимы
печени и опухолевых тканей имеют низкие значения в видимом диапазоне
спектра, что связано с высокими абсорбционными свойствами крови. В этом
случае целесообразно определение насыщения кислородом в инфракрасном
(ИК) диапазоне, которое в меньшей степени зависит от содержания крови, с
помощью подхода, описанного в [408].
Результаты расчетов пика флуоресценции на длинах волн возбуждения
365 нм (I
365
) и 450 нм (I
450
), а также тканевой сатурации (S
t
O
2
) в условно
здоровой паренхиме печени и в опухоли представлены в таблице 3.1. Из-за
несимметричности закона распределения данные представлены в формате Me
[Q1-Q3], где Me – медиана, Q1 – первый квартиль, Q3 – третий квартиль.
168
Таблица 3.1 – Результаты расчета диагностических параметров,
полученных методами ФС и СДО, для паренхимы печени и опухоли
Область
измерения
Пик
флуоресценции
на длине волны
возбуждения
365 нм, I
365
, нм
Пик
флуоресценции
на длине волны
возбуждения
450 нм, I
450
, нм
Тканевая
сатурация, S
t
O
2
,
%
Паренхима
печени
508 [505-512]
531 [523-537]
81,9 [79,5-82,8]
Опухоль
502 [500-503]*
520 [518-524]*
86,7 [85,7-89,7]*
* – статистическая значимость различий значений подтверждена при
p < 0,001 с помощью критерия Манна-Уитни
Как и в экспериментальных исследованиях на животных, была
обнаружена статистически значимая разница в насыщении кислородом двух
типов тканей. Сатурация опухолевых тканей оказалась выше, чем в условно
здоровых тканях печени.
Из-за неконтролируемого распространения опухолевых клеток при
отсутствии эффективного кровоснабжения возникает гипоксия. В этих
условиях увеличивается выработка ангиогенных факторов и начинается
активная васкуляризация опухоли. Широко признано, что метастазы и
первичные опухоли в печени кровоснабжаются преимущественно
артериальной кровью [427]. Гипоксическая модель опухоли не в состоянии
описать все метаболические изменения, поддерживающие активный рост
клеток. Существует значительная меж- и внутриопухолевая изменчивость в
степени гипоксии, при которой оксигенация опухоли является довольно
неоднородной, и наблюдаются области легкой гипоксии, а также области
острой гипоксии и реоксигенации. Полученные данные показывают, что, хотя
опухоль печени является гипоксической, значительная часть её клеток хорошо
насыщена кислородом.
169
3.1.4 Алгоритм классификации данных
Для синтеза правила принятия решений с целью разделения тканей на
два класса (опухоли и условно нормальные ткани) был использован метод
опорных векторов (SVM) [428], реализованный в среде Matlab. Он преобразует
исходное пространство данных в новое, более многомерное, где данные могут
быть проще разделены гиперплоскостью. Это достигается через ядро, которое
позволяет выполнить нелинейное преобразование данных. Первым шагом
является подготовка данных, которая включает в себя масштабирование
признаков и разбиение данных на обучающую и тестовую выборки. Затем
создается SVM-модель с определенным типом ядра, которая обучается на
обучающей выборке.
Основная идея метода опорных векторов (SVM, Support Vector Machine)
заключается в нахождении оптимальной гиперплоскости, разделяющей
классы данных в многомерном пространстве признаков. Рассмотрим
математическое описание этого метода. Пусть у нас есть обучающая выборка
{(x
i
, y
i
)}
n
i=1
, где x
i
ℝ
d
– это вектор признаков, соответствующий i-му объекту;
y
i
{-1, 1} – это метка класса, к которому принадлежит объект x
i
.
Задача заключается в том, чтобы найти такую гиперплоскость в
пространстве признаков, которая максимально разделяет объекты разных
классов. Эта гиперплоскость задается линейным уравнением:
w
T
x + b = 0, (3.1)
или для трехмерных данных:
w
1
x
1
+ w
2
x
2
+ w
3
x
3
+ b = 0 (3.2)
где w ℝ
d
– это вектор весов, перпендикулярный гиперплоскости
(определяют наклон гиперплоскости); b ℝ – смещение гиперплоскости.
170
Классификатор, основанный на этой гиперплоскости, будет относить
объект x к классу K1, если вектор признаков лежит на положительной стороне
гиперплоскости w
T
x + b > 0, и к классу K2, если вектор признаков лежит на
отрицательной стороне гиперплоскости w
T
x + b < 0:
.
2 класс0 < +
1 класс 0 > +
T
T
→
→
Кxbxw
Кxbxw
(3.3)
При построении трехмерного классификатора SVM с использованием
параметров пика флуоресценции на длине волны возбуждения 365 нм (I
365
),
пика флуоресценции на длине волны возбуждения 450 нм (I
450
), тканевой
сатурации (S
t
O
2
), а также двумерных классификаторов с использованием
сочетаний параметров I
365
, I
450
;
I
365
, S
t
O
2
и I
450
, S
t
O
2
получены следующие
значения уравнений:
1. Для трех параметров (I
365
, I
450
;
S
t
O
2
): w = [-0.139; 0.107; -1.01], b = 98.95;
2. Для двух параметров (I
365
, I
450
): w = [0.282; 0.136], b = -213.54;
3. Для двух параметров (I
365
, S
t
O
2
): w = [-0.075; -1.019], b = -123.32;
4. Для двух параметров (I
450
, S
t
O
2
): w = 0.062; -0.861], b = 39.77
Для обеспечения стабильности классификации и избежания
переобучения применялся метод поэлементной кросс-валидации (Leave-One-
Out Cross Validation).
На рисунке 3.8 приведены результаты построения всех предложенных
классификаторов SVM.
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана