Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_1449_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
171
а)
б)
в)
г)
Рисунок 3.8 – Результаты построения классификаторов: (а) 3D график
разброса данных и поверхность принятия решения для трехмерного
классификатора SVM (I
365
, I
450
, S
t
O
2
); диаграммы рассеяния и линии принятия
решений двумерных классификаторов для диагностических параметров: (б)
I
365
, I
450
; (в) I
365
, S
t
O
2
; (г) I
450
, S
t
O
2
В таблице 3.2 приведены параметры эффективности разработанных
классификаторов при использовании всех трех диагностических параметров
(I
365
, I
450
, S
t
O
2
), а также при их различном попарном сочетании.
172
Таблица 3.2 – Параметры эффективности предложенных
классификаторов дифференциации условно здоровой паренхимы печени и
опухоли на основе данных, полученных с помощью мультимодального
устройства, реализующего методы ФС и СДО
Параметр
I
365
, I
450
,
S
t
O
2
I
365
, I
450
I
365
, S
t
O
2
I
450
, S
t
O
2
Чувствительность
0,90
0,75
0,90
0,90
Специфичность
0,95
0,85
0,90
0,95
Самый высокий уровень диагностической эффективности достигается
при использовании в качестве диагностических параметров сочетания
параметров максимальной амплитуды флуоресценции, возбужденной на
длине волны 450 нм, и насыщения тканей кислородом или в случае
использования всех трех параметров. Наличие двух источников излучения
(365 и 450 нм) может быть многообещающим в других реализациях системы
оптической биопсии с тонкоигольным оптоволоконным зондом, например, в
измерениях времени жизни флуоресценции. Данный подход позволит
избежать проблем с анализом абсолютной амплитуды спектров
флуоресценции и поможет провести детальный анализ метаболических
процессов в опухолях печени.
3.1.5 Синтез метода дифференциации новообразований и паренхимы
печени
На основе проведённых исследований с учетом разработанного
классификатора, а также особенностей пункционного МИХВ разработан
алгоритм метода дифференциации новообразований и паренхимы печени,
схема которого представлена на рисунке 3.9.
173
Рисунок 3.9 – Схема алгоритм метода дифференциации новообразований и
паренхимы печени
Перед началом ЧПБ печени ассистенты врача-хирурга готовят
стерильный набор инструментов, в том числе оптоволоконный зонд.
Проводится калибровка мультимодального устройства с каналами ФС и СДО,
путем регистрации калибровочного спектра от эталона диффузного отражения
и темнового тока. Также осуществляется контроль выходной мощности
источников излучения.
Процедура проведения ЧПБ включает подготовку пациента к
проведению пункционного МИХВ: пациент располагается в положении лежа
на спине, проводится дезинфекция операционного поля 70%-ным раствором
этанола и обкладывание стерильными пеленками. После этого врач-оператор
определяет местоположение новообразования печени с помощью УЗИ и на
этом основании строит предполагаемую траекторию введения иглы по
кратчайшему безопасному расстоянию от кожи до очага-мишени. Далее врач-
174
оператор отмечает на коже место прокола и проводит местное обезболивание
путем введения местного анестетика (2 % раствор лидокаина гидрохлорида)
этой области под ультразвуковым контролем. Пункционная игла типа Chiba
17,5 G вводится по ранее намеченной трассе в паренхиме печени до
опухолевого образования. По ходу движения инструмента в патологическом
очаге из иглы извлекается стилет, в канюлю вставляется оптоволоконный зонд
для подведения рабочей поверхности к целевому участку ткани. Поочередно
регистрируются оптические сигналы в каналах ФС (с источниками
возбуждения 365 и 450 нм) и СДО. После этого производится обработка
спектров: автоматический расчёт параметров пиков флуоресценции I
365,
I
450
и
тканевой сатурации S
t
O
2
и на их основе классификатором определяется
принадлежность исследуемой ткани к классу опухоли. В случае, когда область
исследования определена классификатором как «опухоль», из биопсийной
иглы извлекается оптический зонд и проводится забор биоптата опухолевой
ткани с помощью вращательной техники. Если же на основании
классификации данных область исследования определена как паренхима
печени, необходимо выбрать новый целевой участок и повторить действия по
регистрации и обработке оптических сигналов. После забора биоптата
проводится фиксация полученных образцов биоткани 10 %-ным раствором
формалина и передача в патоморфологическую лабораторию для дальнейшего
анализа. На место пункции накладывается стерильная асептическая повязка.
Предлагаемый метод может быть использован для усовершенствования
стандартной процедуры ЧПБ очагового и диффузного поражения печени и
служит для получения дополнительной диагностической информации в
режиме реального времени, позволяющей классифицировать ткани на два
класса для возможности интраоперационной навигации пункционных игл.
Метод может быть применен не только для диагностики злокачественных
новообразований печени, но и для навигации дистального конца пункционной
иглы при выполнении ЧПБ других органов после проведения
соответствующих дополнительных клинических исследований.
175
3.2 Метод классификации новообразований печени
3.2.1 Экспериментальное исследование опухолевых новообразований у
биологических моделей с помощью флуоресцентной спектроскопии с
временным разрешением для интраоперационной оценки тканевого
метаболизма
Прогноз для больных с опухолевым поражением печени зависит от ряда
факторов: гистологический тип опухоли и степень злокачественности, размер
и количество очагов, уровень тяжести поражения печени, возраст и пол
пациента, общее состояние здоровья и сопутствующие заболевания.
Морфологическая верификация опухолей является унифицированной, однако
сам процесс гистологического или цитологического анализа требует времени,
ресурсов и привлечения высококвалифицированных врачей. Поиск
технологий, позволяющих дать ответ о типе новообразований в экспресс-
режиме диагностики безусловно является одной из передовых задач
современной медицины. Знание о типе опухоли печени и уровне её
злокачественности может помочь в подборе персонализированной стратегии
лечения пациентов и их своевременной маршрутизации в клинические
центры, осуществляющие аббляционные методики лечения и
высокотехнологические операции по трансплантации печени [429–431].
Таким образом, разработка метода классификации новообразований
печени (первичные злокачественные опухоли, метастазы, доброкачественные
новообразования) является актуальной задачей, решение которой может
позволить получить предварительное представление о типе опухоли во время
проведения пункционного МИХВ. Так как известно, что онкологические
метаболические перестройки обуславливают изменение пути утилизации
глюкозы, что связано с изменениями относительного содержания свободного
и связанного с белками кофактора НАДН, то для их регистрации был выбран
метод ФС с временным разрешением. Данный метод обладает высокой
176
чувствительностью к межмолекулярным взаимодействиям [253,432] и
позволяет распознавать эндогенные флуорофоры с перекрывающимися
спектрами.
Для обоснования клинических исследований были проведены
преклинические эксперименты по оценке метаболических параметров
опухолевых новообразований у лабораторных животных (мышей).
Экспериментальные исследования проводились в соответствии с принципами
надлежащей лабораторной практики GLP (согласно ГОСТ 33647-2015). Работа
была одобрена этическим комитетом ФГБОУ ВО «Орловский
государственный университет имени И.С. Тургенева» (протокол № 12 от
06.09.2018 г.).
Схема устройства, реализующего метод ФС с временным разрешением,
приведена на рисунке 3.10.
Рисунок 3.10 – Структурная схема устройства ФС с временным разрешением
с тонкоигольным оптоволоконным зондом
Система рассчитана на регистрацию флуоресценции кофермента
177
метаболизма НАДН в его свободном и связанном с белками состоянии [433].
Для возбуждения флуоресценции на длине волны 375 нм использовался
лазерный источник BDS-SM-375-FBC-101 (Becker & Hickl, Германия). Для
подсчета фотонов использовался гибридный фотоприемник HPM-100-40
(Becker & Hickl, Германия) со спектральным диапазоном чувствительности
250-720 нм и квантовой эффективностью 45 % (для 500 нм). Для выделения
интересующей спектральной области флуоресцентного излучения
использовался полосовой фильтр MF479-40 (ThorLabs, США).
Оптическая мощность УФ-излучения после оптического волокна
составляла 0,2 мВт. Время экспозиции для измерения одного спектра – 1 с.
Используемый тонкоигольный оптоволоконный зонд был описан в
пункте 3.1.1.
В преклинических исследованиях была использована описанная выше
экспериментальная животная модель, которая представляла собой гибридную
мышь BDF (C57Bl6xDBA) с перевитой путем инъекции в правую медиальную
долю печени суспензии клеток линии Н33 ГЦК мыши. Всего в процедуре
использовалось 6 лабораторных животных с поздней стадией развития
опухоли ГЦК и 4 здоровых контрольных мыши, предоставленные НМИЦ
онкологии им. Н.Н. Блохина (Москва, Россия). Исследования проводились не
ранее, чем через 3 месяца после инокуляции. Позднюю стадию рака печени
определяли при динамическом наблюдении за животными.
Регистрация оптических сигналов была проведена в опухоли, в
прилегающих к ней участках печени, а также в печени здоровых мышей. На
рисунке 3.11 представлены типичные кривые затухания флуоресценции,
полученные с помощью устройства, реализующего метод ФС с временным
разрешением, зарегистрированные в печени мышей контрольной группы и в
опухоли мышей с ГЦК.
178
а)
б)
Рисунок 3.11 – Примеры кривых затухания флуоресценции,
зарегистрированных в печени контрольных животных (а) и в опухоли
мышей, имеющих смоделированную ГЦК (б)
Для количественной оценки затухания флуоресценции был применен
алгоритм аппроксимации кривых по методу наименьших квадратов к модели
двухэкспоненциального затухания:
I(t) = I
0
[α
1
·exp (−(t+t
0
)/τ
1
)+ α
2
·exp (−(t+t
0
)/τ
2
)], (3.4)
где I(t) – интенсивность флуоресценции через время t, число фотонов;
I
0
– максимальный сигнал флуоресценции (первоначальная
интенсивность флуоресценции после прекращения возбуждения), число
фотонов;
t
0
– временная задержка регистрации максимума флуоресценции, нс;
τ
1
и τ
2
– времена жизни флуорофора, нс:
τ
1
– короткое время жизни флуоресценции;
τ
2
– длительное время жизни флуоресценции;
α
1
и α
2
– относительные вклады компонент времени жизни, %:
179
α
1
– относительный вклад компоненты с коротким временем жизни
флуоресценции;
α
2
– относительный вклад компоненты с длительным временем жизни
флуоресценции.
При этом (α
1
+ α
2
= 100%).
Определение параметров τ
1
, τ
2
, α
1
и α
2
проводилось в стандартной
программе SPCImage NG Data Analysis Software (Becker & Hickl, Германия), в
которой параметры выбранной модели оптимизируются до тех пор, пока
кривая фиттинга не ляжет на экспериментальные точки наилучшим образом.
Критерием качества подгонки кривой является близость к единице
среднеквадратичного отклонения экспериментальных данных от модельной
функции (χ
2
) и малость флуктуации невязки.
На рисунке 3.12 приведены результаты расчета основных параметров,
полученных в результате исследования метаболических параметров опухоли,
паренхимы печени, окружающей опухоль, а также печени контрольных
животных методом ФС с временным разрешением.
При анализе данных было отмечено, что интенсивность флуоресценции
в узлах ГЦК была значительно выше (более чем в два раза), чем в тканях
печени здоровых контрольных животных (рисунок 3.12а). При этом уровень
интенсивности флуоресценции в тканях печени, прилегающих к участкам
ГЦК, существенно не отличался от значений, измеренных в опухоли. Данный
факт ставит под сомнение использование интенсивности флуоресценции в
качестве единственного параметра для различения опухолей поздней стадии,
связанных с ГЦК, и прилегающей паренхимы печени.
180
а)
б)
в)
г)
Рисунок 3.12 – Результаты расчета основных параметров, полученных в
результате исследования метаболических параметров опухоли, паренхимы,
окружающей опухоль, а также печени контрольных животных методом ФС с
временным разрешением.
*** – статистическая значимость различий значений подтверждена при p <
0,001 с помощью критерия Манна-Уитни
Объяснением наблюдаемому увеличению уровня флуоресценции в
тканях печени, прилегающих к участкам ГЦК, может быть увеличение вклада
НАДФН. Это предположение также подтверждается увеличением
длительности компоненты τ
2
и снижением относительного отношения α
1
/α
2
.
Совместный анализ данных позволяет предположить, что основной причиной
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана