Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_1449_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
101
Продолжение таблицы 1.4
1
2
3
4
5
6
7
1) СДО
2) ФС с временным
разрешением (λ
ex
=
355 нм)
СДО: коэффициенты
поглощения и рассеяния.
ФС с временным разрешением:
интенсивность флуоресценции
на длинах волн,
ассоциированных с коллагеном,
НАДН и ФАД, времена жизни
при 400, 460 и 515 нм
Алгоритм
определения
диагностических
параметров
В опухоли наблюдалось
статистически значимое
увеличение значений
коллагена, НАДН,
интегральной площади
отношения НАДН/ФАД,
коэффициентов
поглощения и рассеяния, а
также уменьшение
значений ФАД
[354]
6
Мониторинг
эффективности
системного
лечения рака
молочной железы
1) СДО
2) ФС (λ
ex
= 377 нм)
СДО: объемные доли воды,
липидов, концентрация
гемоглобина, тканевая
сатурация, параметры
рассеяния.
ФС: общая интенсивность
флуоресценции, вклад
интенсивности флуоресценции
коллагена и эластина, вклад
интенсивности других
флуорофоров, редокс-
отношение
Алгоритм
определения
диагностических
параметров
СДО: опухоли после
лечения показали
значительное снижение
наклона рассеяния Ми и
фракции рассеяния Ми к
общему, а также
увеличение доли объема
жира, оксигенации тканей.
ФС: увеличение вклада
интенсивности коллагена
и других флуорофоров
[355]
Мозг
7
Классификация
здоровой,
окружающей
опухоль и
злокачественной
тканей мозга
1) СДО
2) ФС (λ
ex
= 337 нм)
СДО: отношения
коэффициентов отражения на
различных длинах волн.
ФС: отношения интенсивности
флуоресценции на различных
длинах волн
ЛДА
Опухоль-нормальная
ткань: Se = 80 %, Sp = 89
%
Опухоль-
инфильтрирующие края:
Se = 94 %, Sp = 93 %
[356]
102
Продолжение таблицы 1.4
1
2
3
4
5
6
7
1) СДО
2) ФС с временным
разрешением (λ
ex
=
355 нм)
СДО: коэффициенты
поглощения и рассеяния
ФС: время жизни
флуоресценции
Алгоритм
определения
диагностических
параметров
Система способна
извлекать
флуоресцентные и
оптические свойства
тканей
[357]
8
Классификация
глиом:
мультиформные
глиобластомы и
глиомы низкой
степени
злокачественност
и
1) СДО
2) ФС с временным
разрешением (λ
ex
=
355 нм)
СДО: коэффициент отражения
на длине волны 650 нм (R650),
оптические свойства на длине
волны 650 нм (μa,650 и μs,650′),
ФС: отношение интенсивности
флуоресценции к отражению на
длине волны 460 нм (F/R)
460
и
время жизни флуоресценции на
длине волны 460 нм (τ460)
ЛДА
Se = 100 %, Sp = 90 %
[358]
Печень
9
Дифференциация
стадий фиброза
1) СДО
2) ФС (λ
ex
= 330 нм)
СДО: коэффициенты отражения
на длинах волн 545 и 650 нм
(R(545)) и (R(650)).
ФС: отношение интенсивностей
флуоресценции на длинах волн
500 и 680 нм (F(500)/F(680))
ЛДА
Se = 80 %, Sp = 85 %
[359]
1) СДО
2) ФС (λ
ex
= 365 нм)
СДО: коэффициент отражения
на длине волны 365 нм (R365).
ФС: Интенсивность
флуоресценции на длине волны
493 нм (АF493)
Алгоритм
определения
диагностических
параметров
Se = 85 %, Sp = 100 %
[360]
103
Наибольший интерес представляют инструментальные
мультимодальные системы МИХ, которые были использованы in vivo.
Под руководством упомянутого выше Theo J.M. Ruers была разработана
система с комплементарным применением методов СДО и ФС (λ
ex
= 377 нм) с
целью идентификации колоректальных метастазов в печени in vivo [361].
Спектры регистрировались через специально спроектированные одноразовые
иглы 15G (рисунок 1.36). Общая чувствительность и специфичность метода
СДО составили 95% и 92%, соответственно. Наиболее дискриминантным был
параметр, описывающий объемное содержание желчи. Добавление в
классификационный анализ данных, полученных в канале ФС, не улучшило
общую диагностическую точность метода.
Рисунок 1.36 – Проведение оптической биопсии печени in vivo [361]
Интересной представляется мультимодальная система оптической
спектроскопии для улучшения клинического выявления аденокарциномы
поджелудочной железы во время проведения тонкоигольной пункционной
аспирационной биопсии (рисунок 1.37) [362]. Разработанный оптоволоконный
зонд совместим с ангиокатетером 14 G и вводится в зону интереса после
извлечения из иглы стилета. Анализ спектральных отношений в каждом из
каналов диагностики показал статистически значимые количественные
различия между аденокарциномой и нормальными тканями, измеренные in
vivo.
104
Рисунок 1.37 – Мультимодальная система оптической спектроскопии для
выявления аденокарциномы поджелудочной железы [362]
Таким образом, рассмотренные оптические технологии представляются
весьма перспективными для решения целого ряда диагностических задач при
МИХВ, однако, требуют их методологической проработки с
совершенствованием технических средств.
1.3 Предварительные экспериментальные исследования
диагностических возможностей оптических методов при патологических
нарушениях (микроскопия и неинвазивная оптическая диагностика)
1.3.1 Исследование биоэнергетических процессов и окислительно-
восстановительного гомеостаза опухоли на клеточном и тканевом
уровнях методами флуоресцентной микроскопии
С целью оценки возможностей описанных в предыдущем параграфе
методов ОД определять перфузионно-метаболические характеристики
биологических тканей были проведены предварительные исследования на
клеточном и тканевом уровнях.
Для исследования функции аэробного клеточного дыхания в
опухолевых клетках оценивались параметры коферментов цикла Кребса – пул
105
и редокс-индекс НАДН и ФАД. В качестве модели была использована
клеточная культура Н33 гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) мыши.
Измерения проводились на конфокальном микроскопе ZEISS LSM 900 с
системой Airyscan 2 (Carl Zeiss AG, Германия).
В течение 3 мин регистрировали базовый уровень автофлуоресценции
НАДН и ФАД в клетках Н33 (рисунок 1.38), после чего в измерительную
ячейку вносили раствор карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразона
(FCCP) (1 мкмоль/л) и регистрировали автофлуоресценцию при максимальной
активности дыхательной цепи. Для оценки работы биоэнергетики были
рассчитаны параметры содержания НАДН и ФАД, а также редокс-индекс
НАДН и ФАД по методике, подробно описанной в [363].
a)
б)
Рисунок 1.38 – Конфокальное изображение автофлуоресценции
НАДН и ФАД в клетках ГЦК Н33
По результатам измерений содержание НАДН в клетках ГЦК Н33
составило 60±18 усл. ед., ФАД – 64±28 усл. ед. Редокс-индекс НАДН и ФАД
составил 51±14 % и 44±17 %, соответственно.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования
показателей эндогенной флуоресценции в оценке функционирования
митохондрий и аэробного клеточного дыхания в опухолевых клетках.
Оценивая пул и редокс-индекс НАДН и ФАД, становится возможным
охарактеризовать активность цикла Кребса и ЭТЦ митохондрий.
106
На следующем этапе для выявления изменений метаболической
активности в культуре клеток ГЦК H33 были использованы визуализация
интенсивности автофлуоресценции НАД(Ф)Н и расчет параметров времени
жизни с помощью системы для регистрации времени жизни флуоресценции
(FLIM) в частотной области на основе камеры с двухканальным КМОП-
сенсором (pco.flim, PCO GmbH, Германия), реализующей измерения в
частотной области и работающей с частотой модуляции 40 МГц и
разрешением изображения 1008×1008 пикселей [364]. Для возбуждения
автофлуоресценции в клетках использовали лазер с длиной волны 375 нм
(PCO AG, Германия). Камера была подключена к инвертированному
биологическому микроскопу IX73 (Olympus, Япония) с 40× объективом.
Время экспозиции составляло 500 мс. Мощность лазера не превышала 10 мВт.
Время жизни флуоресценции оценивали по сдвигу фазы и изменению
коэффициента модуляции регистрируемого излучения флуоресценции
относительно амплитудно-модулированного возбуждающего излучения.
Для моделирования изменений метаболизма в культуре клеток ГЦК H33
использовались известные фармакологические агенты
(дегидроэпиандростерон (DHEA), йодуксусная кислота (ЙУК),
карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) и ротенон),
которые могут моделировать различные метаболические изменения, включая
влияние на окислительно-восстановительные состояния пулов НАДН и
НАДФН. DHEA является ингибитором глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
(G6PDH), ограничивающим скорость в ПФП. ЙУК является ингибитором
гликолиза, FCCP является разобщающим агентом митохондриальной цепи
переноса электронов, ротенон действует как сильный ингибитор комплекса I
дыхательной цепи митохондрий.
Измеренные клетки включали контрольную группу (N=9), одну,
обработанную ЙУК (20 мкМ, N=4) за 2 ч до измерений, и одну, обработанную
DHEA (10 мкМ, N=4) за 15 мин до измерений. Измерения включали
регистрацию сигнала базальной флуоресценции, сигнала флуоресценции
107
после добавления разобщителя окислительного фосфорилирования FCCP
(0,2 мМ) и ингибитора комплекса I ротенона (0,02 мМ). Измерения длились
15 мин.
Система визуализации была откалибрована на свежем 0,1 мМ растворе
НАДН. Репрезентативные примеры фазовых графиков автофлуоресценции,
полученных из раствора НАДН и клеток ГЦК после процедур калибровки,
показаны на рисунке 1.39, а и б, соответственно. Распределение точек на
полуокружности (рисунок 1.39а) предполагает чистое одноэкспоненциальное
затухание измеренного сигнала от раствора НАДН. Распределение точек
данных на изображениях, полученных из клеток H33 (рисунок 1.39б),
указывает на наличие нескольких источников флуоресценции с различными
временами жизни.
а)
б)
Рисунок 1.39 – Репрезентативные примеры фазовых графиков
автофлуоресценции раствора НАДН (а) и клеток ГЦК (б)
На рисунке 1.40 в левой панели показаны карты интенсивности
флуоресценции (первый столбец) и времени жизни сдвига фазы (второй
столбец) и сдвига модуляции (третий столбец) клеток H33 в контроле (первая
строка), экспериментах с ЙУК (вторая строка) и DHEA (третья строка).
108
Рисунок 1.40 – Карты интенсивности и времени жизни флуоресценции
клеток H33 в контрольных (а, б, в– левая часть), с ЙУК (г, д, е) и с DHEA (ж,
з, и) экспериментах, анализируемые параметры содержания НАДН (а – левая
часть), окислительно-восстановительный индекс НАДН (а – правая часть) и
параметры флуоресценции на основе фазы (б– правая часть) и модуляции (в–
правая часть), характеризующие первую и вторую составляющие времени
жизни флуоресценции при различных метаболических условиях
Анализируемые параметры (правая панель рисунка 1.40) включали пул
НАДН, окислительно-восстановительный индекс НАДН, а также сдвиги фазы
и модуляции, характеризующие первую и вторую компоненты затухания
времени жизни флуоресценции. Статистическую значимость различий
оценивали с помощью одностороннего теста ANOVA (р<0,05).
Результаты продемонстрировали снижение среднего пула НАДН как в
группе ЙУК, так и в группе DHEA (41±27 отн.ед., 37±7 отн.ед., 30±18 отн.ед.
соответственно), в то время как окислительно-восстановительный индекс
НАДН увеличился больше в группе ЙУК (53±27%, 76±16%, 70±17%). Более
низкие значения окислительно-восстановительного индекса указывают на
109
более выраженную дыхательную активность клеток. Разобщающее
фосфорилирование вызывало уменьшение первого и второго компонентов
времени жизни флуоресценции в экспериментах с контролем, ЙУК и DHEA.
Ингибирование активности цепи переноса электронов путем добавления
ротенона, блокатора НАДН-дегидрогеназы (комплекс I), увеличивало
взвешенное время жизни двух компонентов во всех экспериментах.
Следовательно, можно сделать вывод, что применение ингибиторов в разной
степени ухудшало состояние клеток. Наблюдаемые изменения могут
указывать на то, что раковые клетки печени используют процесс гликолиза
для окисления глюкозы и выработки энергии в форме АТФ в большей степени,
чем ПФП. Ингибирование гликолиза более важно для жизнеспособности этой
культуры клеток. Ингибирование гликолиза ЙУК привело к значительному
снижению первого и второго компонентов времени жизни флуоресценции в
базальных измерениях (53,8% и 7,4%, соответственно). Напротив,
ингибирование ПФП с использованием DHEA привело к статистически
значимому увеличению этих параметров в базовом тесте (22,2% и 11,4%,
соответственно). Все три группы показали схожую динамику изменений.
Однако в контрольной группе наблюдался значительный разброс полученных
значений, что затрудняло более подробную оценку возможных изменений
соотношения связанного и несвязанного НАД(Ф)Н [364].
Несмотря на предыдущие выводы, известно, что метаболическая
адаптация при опухолях выходит за рамки аэробного гликолиза, и
использование показателя гликолиза в качестве единственного
диагностического критерия для выявления злокачественных новообразований
в настоящее время считается ненадежным. Не менее важным путем
утилизации глюкозы является ПФП, который производит пентозофосфаты для
поддержки увеличения синтеза нуклеиновых кислот и снижения выработки
НАДФН [109]. Кофактор НАДФН необходим для биосинтеза жирных кислот
и холестерина, играет важную роль в производстве восстановленного
глутатиона (GSH), основного поглотителя АФК, а также в производстве
110
оксида азота NO, и используется оксидазами НАДФН [110]. Поэтому на
следующем этапе были исследованы изменения окислительно-
восстановительного баланса в острых срезах тканей опухоли ГЦК и
прилегающей печени.
Экспериментальная модель опухоли печени представляла собой
гибридную мышь BDF (C57Bl6xDBA) с инокулированной путем инъекции в
печень суспензии клеток ГЦК Н33 мыши. Экспериментальные исследования
проводились в соответствии с принципами надлежащей лабораторной
практики GLP (согласно ГОСТ 33647-2015). Работа была одобрена этическим
комитетом Орловского государственного университета имени И.С. Тургенева
(протокол № 12 от 06.09.2018 г.). Всего в исследовании использовалось 8
мышей с начальной стадией развития опухоли ГЦК и 4 здоровых контрольных
животных, предоставленных НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (Москва).
Для исследования уровня АФК использовался флуоресцентный зонд
дигидроэтидий (HEt) [365]. Оценку внутриклеточного содержания GSH
проводили путем инкубирования клеток в растворе монохлорбимана (MCB),
способного к образованию флуоресцирующих конъюгатов с
низкомолекулярными соединениями, содержащими SH-группу.
Для измерения общей продукции АФК и содержания GSH использовали
установку флуоресцентной микроскопии [366] в двух вариантах: со
светодиодом M455F1 (Thorlabs Inc., США) для возбуждения флуоресценции
продуктов окисления HEt (Invitrogen, США) или светодиодом M365F1
(Thorlabs Inc., США) для возбуждения флуоресценции продукта конъюгации
в реакции между MCB (Invitrogen, США) и GSH. Для измерения GSH срезы
предварительно загружали 50 мкм раствором MCB. Измерения MCB были
сделаны по 5 изображениям с каждого среза.
Скорость производства АФК рассчитывали как скорость увеличения
флуоресценции HEt. Скорость повышения флуоресценции HEt и уровня
флуоресценции MCB в здоровой ткани печени контрольных животных
нормировали до 1, а все остальные измерения корректировали относительно
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана