Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_1449_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
231
группами были получены статистически значимые различия по критерию
Манна-Уитни (p < 0,05).
Таблица 4.6 – Результаты расчета диагностических параметров,
полученных методом ФС и СДО, для центральной части новообразования,
периферической области опухолевой ткани и неизмененной железистой ткани
молочной железы
Область
измерения
Максимум флуоресценции в спектре
ФС, I
F365
, отн.ед.
Тканевая сатурация, S
t
O
2
, %
РМЖ
Фиброаденома
РМЖ
Фиброаденома
Центральная
часть опухоли
6160
[2190-8810]
2960
[1920-4300]
6,6
[5,7-24,8]
*
#
66,3
[43,7-74,8]
Периферия
опухолевой
ткани
4580
[2440-6660]
#
2930
[1730-4150]
47,8
[23,0-61,4]
70,5
[63,5-86,4]
Неизмененная
железистая
ткань
молочной
железы
8280
[5650-14100]
#
2710
[2510-2920]
79,0
[77,6-84,4]
66,9
[64,3-69,5]
Для определения различий показателей внутри одной группы применяли
критерий Краскела-Уоллиса (*), для сравнений между группами использовали
критерий Манна-Уитни (#). Различия считали статистически значимыми при
p < 0,05.
Известно, что кислородный статус опухолей связан с их возможностью
ответа на проводимое химиотерапевтическое лечение [481,482]. Вероятно это
связано с тем, что в тех опухолях, где микроциркуляторная сеть достаточно
хороша развита и регулярна, а кровоснабжение адекватно соответствует их
размеру и интенсивности метаболических процессов, доставка к тканям
кислорода и терапевтических агентов происходит эффективно. Полученные
данные о пониженной сатурации в злокачественных новообразованиях
молочной железы согласуются с исследованиями, проведенными ранее
методом оптической диффузионной томографии, в ходе которых показано, что
в центре РМЖ уровень насыщения кислородом по сравнению с окружающими
232
тканями снижен [483]. Также полученные результаты согласуются с данными,
опубликованными в [217], где показано, что тканевая сатурация в центре РМЖ
значительно ниже, чем в доброкачественных новообразованиях.
При анализе данных в канале ФС было выявлено, что злокачественные
опухоли имеют тенденцию к более высоким значениям интенсивности
флуоресценции при возбуждении на длине волны 365 нм по сравнению с
доброкачественными. Также наблюдалось статистически значимое
увеличение интенсивности флуоресценции в неизмененных тканях молочной
железы пациенток с РМЖ по сравнению со второй группой обследуемых с
фиброаденомой,
в периферической области новообразований также отмечена
статистически значимая разница в изменении данного показателя.
Большая часть исследований, в основу которых положена регистрация
интенсивности флуоресценции, возбужденной на длинах волн около 360 нм,
указывает на повышенные концентрации НАДН и коллагена в
злокачественных тканях по сравнению с неизмененной тканью молочной
железы [273,484]. При переходе клеток на анаэробный гликолиз в условиях
гипоксии изменение цепи дыхательных ферментов инициализируется на
НАДН-зависимом участке, что выражается в кратковременном усилении, а
затем подавлении работы этого участка митохондриального комплекса.
Гипоксия приводит к накоплению НАДН и усилению его автофлуоресценции,
что позволяет использовать его как маркер нарушения функции митохондрий,
вызванных дефицитом кислорода в клетках [75]. Увеличение интенсивности
коллагена обусловлено тем, что при трансформации нормальной ткани в
злокачественную происходит деградация и изменение поперечных связей
коллагена, вызванных повышенным присутствием коллагеназы в опухолевых
клетках [485]. Наблюдаемое увеличение максимума в спектре интенсивности
флуоресценции, возбужденной на длине волны 365 нм в группе с РМЖ, также
может быть связано с увеличением концентрации НАДН в условиях гипоксии.
Однако, стоит отметить, что разделить влияние НАДН и коллагена при таком
подходе к анализу данных (поиск максимума в сигнале ФС) не является
233
возможным, поэтому, скорее всего, дополнительно это обусловлено
изменением структуры коллагенового матрикса.
Увеличение интенсивности флуоресценции в здоровых тканях молочной
железы, окружающих опухоль, у пациенток с диагнозом РМЖ может говорить
о том, что в железистой ткани происходят метаболические перестройки,
обусловленные наличием злокачественной опухоли. Обнаружение таких
изменений в нормальных тканях молочных желез при обследовании
пациенток с подозрением на РМЖ потенциально может служить
диагностическим предиктором малигнизации новообразований молочных
желез.
На данном этапе исследований с учетом полученных данных и данных
из литературных источников было принято решение, что метаболический
статус опухоли наиболее хорошо отражает параметр тканевой сатурации,
который может выявить низкокислородные новообразования. При этом на
основании экспертного мнения онкологов было принято решение, что уровень
S
t
O
2
ниже 25% может служить границей для выявления гипоксийных
опухолей.
4.3.3 Алгоритм определения метаболического статуса новообразований
молочной железы
На основе проведённых исследований разработан алгоритм определения
метаболического статуса новообразований молочной железы, представленный
на рисунке 4.14.
Перед началом ТАБ молочной железы ассистенты врача-онколога
готовят стерильный набор инструментов, в том числе оптоволоконный зонд.
Проводится калибровка канала СДО, путем регистрации калибровочного
спектра от эталона диффузного отражения, регистрации темнового тока.
234
Рисунок 4.14 – Схема алгоритма определения метаболического статуса
новообразований молочной железы
Непосредственно во время проведения ТАБ проводится подготовка
пациентки к проведению пункционного МИХВ: пациентку располагают в
положении лежа на спине, проводится дезинфекция кожных покровов
операционного поля 70 %-ным раствором этанола. После этого врач
определяет местоположение новообразования молочной железы с помощью
УЗИ и на этой основе строит предполагаемую траекторию проведения
пункционной иглы по кратчайшему безопасному расстоянию от кожи до
патологического очага. Далее врач отмечает на коже место прокола и проводит
местное обезболивание путем введения местного анестетика (2 % раствор
лидокаина гидрохлорида) под ультразвуковым контролем. Пункционная игла
19 G вводится в центр опухолевого образования. После этого из иглы
извлекается стилет, вставляется оптический зонд и регистрируется спектр
диффузного отражения. После этого производится автоматический расчёт
параметра тканевой сатурации S
t
O
2
. На основании полученных данных
принимается заключение о кислородном статусе опухоли.
235
4.4 Интраоперационная оценка микроциркуляции крови в тканях
поджелудочной железы
4.4.1 Исследование взаимосвязи нарушений перфузии крови с
метаболическими изменениями в поджелудочной железе
Острый деструктивный панкреатит является одной из проблем
неотложной хирургии органов брюшной полости. Известно, что перфузионно-
метаболические нарушения в поджелудочной железе являются одним из
ключевых факторов развития осложнений данного заболевания [486].
Ферментативный аутолиз и воспаление ведут к тромбозу сосудов
микроциркуляторного русла с развитием ишемии и некроза ткани
поджелудочной железы [487]. Учитывая вероятностный характер УЗИ в
верификации характера поражения тканей при предполагаемом
панкреонекрозе актуальным представляется вопрос об аргументированном
определении перфузионно-метаболических нарушений органа на ранних
стадиях развития заболевания. В связи с этим разработка новых технологий
для расширения диагностических возможностей лапароскопических МИХВ
при оценке состояния тканей поджелудочной железы является актуальной
задачей.
Для разработки алгоритма оценки перфузионно-метаболических
параметров поджелудочной железы предварительно были проведены
исследования взаимосвязи нарушений перфузии крови с метаболическими
изменениями. Был проведен эксперимент по мониторингу окислительного
обмена тканей у лабораторных мышей с моделью ишемии поджелудочной
железы. Целью проведенного исследования являлся мониторинг ишемических
процессов путем измерения флуоресценции основных коферментов
окислительно-восстановительных реакций – НАДН и ФАД – а также
насыщения тканей кислородом и перфузии в поджелудочной железе
лабораторного животного. Флуоресценцию коферментов регистрировали
236
методом ФС, тканевую сатурацию рассчитывали на основе обработки данных,
полученных методом СДО, контроль кровоснабжения тканей проводили с
помощью метода ЛСКВ.
Экспериментальная установка включала в себя три канала регистрации:
ФС, СДО и ЛСКВ (рисунок 4.15). Измерительный канал ЛСКВ включал в себя
CMOS камеру DCC3260M (Thorlabs, Inc., США) с разрешением 1936×1216 пкс
при размере пикселя 5,86 мкм. Изображение проецировалось на матрицу
камеры через объектив Mitutoyo apochromat objective MY5X-802 (Thorlabs,
Inc., США). Частота записи изображений камерой составляла 15 кадров в
секунду, время экспозиции камеры – 9 мс для всех измерений. Исходные
изображения спеклов передавались на компьютер для последующей
обработки с использованием алгоритма, разработанного в программной среде
MATLAB и позволяющего получать динамическую картину изменения спекл-
контраста в режиме реального времени.
Рисунок 4.15 – Схема экспериментальной установки и процедуры перевязки
поджелудочной железы
237
Для измерения флуоресценции и интенсивности диффузного отражения
использовался лапароскопический оптоволоконный зонд с жесткой
дистальной частью диаметром 3 мм. Для возбуждения эндогенной
флуоресценции биомаркеров в канале ФС использовались источники
излучения с длинами волн 365 нм и 450 нм. Светофильтры FGL400 и FGL495
(Thorlabs, Inc., США) применялись для ослабления обратно отражённого
излучения источников монохроматического светового излучения, которое
вместе с вторичным оптическим излучением от биологической ткани,
поступало в ПЗС спектрометр (Ocean Optics, США), работающий в диапазоне
400-900 нм. Эти фильтры использовались только в канале ФС, и удалялись при
измерении в канале СДО. Источником освещения в канале СДО являлась
галогенная лампа HL-2000-FHSA (Ocean Optics, США) с диапазоном длин
волн 360-2400 нм.
Экспериментальное исследование проводилось на клинически здоровом
лабораторном животном (мышь Balb/c) в соответствии с принципами
надлежащей лабораторной практики GLP (согласно ГОСТ 33647-2015). Работа
была одобрена этическим комитетом ФГБОУ ВО «Орловский
государственный университет имени И.С. Тургенева» (протокол № 10 от
16.10.2017).
Ишемия поджелудочной железы моделировалась путем наложения
лигатуры на область питающих сосудов поджелудочной железы. Затем
животное помещали под оптическую систему для визуализации исследуемой
области и записи последовательностей кадров. Лапароскопический
оптоволоконный зонд помещался в середину визуализируемой области
интереса. Изображения ЛСКВ и спектры ФС и СДО регистрировались до
перевязки и каждые 5 мин после наложения лигатуры в течение часа. Спектры
ФС и СДО были записаны трижды на каждом этапе измерения. После
окончания исследования животное вывели из опыта в соответствии с
правилами проведения экспериментов.
238
Полученные изображения методом ЛСКВ были обработаны с помощью
пространственно-временного алгоритма. Для оценки динамики изменения
микроциркуляции крови производился расчет контраста по формуле:
n
n
I
K
=
, (4.12)
где n – окно усреднения n × n, n = 7;
n
– стандартное отклонение интенсивности;
n
I
– средняя интенсивность.
Исследования, проведенные ранее, показали, что для пространственного
алгоритма ЛСКВ размер окна 7×7 пикселей (n = 7) является оптимальным
между пространственным разрешением и точностью оцениваемого спекл-
контраста [318]. Для максимизации отношения сигнал-шум минимальный
размер спекла должен удовлетворять критерию Найквиста [488]. Таким
образом, размер спекла на камере регулировался путем изменения диаметра
зрачка лапароскопической системы для достижения размера спекла, по
меньшей мере, в 2 раза превышающего размер пикселя. Размер спекла
оценивался с помощью методики, представленной в работе [488].
Для визуального анализа динамики потока рассеивающих частиц
значения рассчитанного пространственного контраста на изображениях были
преобразованы в псевдоцвета, где высокой скорости потока рассеивающих
частиц соответствовал красный цвет, низкой – синий.
Спектры флуоресценции были отнормированы на максимальное
значение флуоресценции. Для регистрации спектров отражения
предварительно проводилась начальная калибровка. Спектры отражения
нормировались на эталон диффузного отражения WS-1 (Thorlabs, Inc., США).
Сатурация рассчитывалась по методике, описанной в пункте 1.3.2 [368].
239
Использовались значения коэффициента отражения в двух изобестических
точках: 545 и 560 нм.
Примеры спекл-контрастного изображения, спектров флуоресценции и
диффузного отражения приведены на рисунке 4.16.
а)
б)
в)
Рисунок 4.16 – Примеры полученных данных: (а) спекл-контрастное
изображение, (б) спектры флуоресценции, (в) спектр диффузного отражения
На рисунке 4.17а приведены спекл-контрастные изображения,
полученные в ходе изучения микроциркуляции крови поджелудочной железы
на различных временных этапах протокола: до перевязки (I) и во время (I-IV)
процедуры наложения лигатуры.
Полученные данные демонстрируют постепенное увеличение значений
спекл-контраста после наложения лигатуры на питающие сосуды
поджелудочной железы, что указывает на замедление кровотока и развитие
моделируемой ишемии тканей для изучения окислительного метаболизма.
Медленное изменение контраста и некоторые его колебания указывают на то,
что венозный кровоток был остановлен не полностью.
240
а)
б)
в)
г)
Рисунок 4.17 – Примеры перфузионно-метаболических изменений на
различных временных этапах протокола наложения лигатуры: (а) спекл-
контрастные изображения, (б) корреляция между флуоресценцией НАДН и
временем после наложения лигатуры, (в) корреляция между флуоресценцией
ФАД и временем после наложения лигатуры, (г) корреляция между тканевой
сатурацией и временем после наложения лигатуры
Результаты обработки измерений, полученных методом ФС (рисунок
4.17б), демонстрируют временную динамику изменения сигнала
флуоресценции при возбуждении на длине волны 365 нм, отражающей НАДН.
Одновременно с увеличением среднего спекл-контраста при ишемии
регистрируется увеличение интенсивности флуоресценции НАДН.
Скорость производства НАДН является прямым отражением
эффективности цикла трикарбоновых кислот. В условиях гипоксии дефицит
кислорода тормозит транспорт электронов в дыхательной цепи, скорость
окисления НАДН ограничивается комплексом I. Течение реакций OXPHOS
становится невозможным, и концентрация НАДН увеличивается. Чтобы
удовлетворить потребность в АТФ, клетка переходит на анаэробный гликолиз,
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана