Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Электрохимические методы анализа. Учебное пособие
.pdf
7 1
ского анализа, а также проводить титрование в неводных средах. Чаще
всего встречаются реакции кислотно-основного и окислительно-восстановительного взаимодействия, реже — комплексообразования и осаждения.
Основным преимуществом косвенных методов потенциометрического
анализа перед прямыми является бóльшая точность, обусловленная резким
изменением потенциала вблизи точки эквивалентности.
Любой метод потенциометрии является безиндикаторным, а значит мо-
жет быть использован при исследовании мутных растворов, а также растворов, имеющих насыщенную окраску.
ГЛАВА 6. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ
Химические сенсоры представляют собой небольшие устройства, которые могут непосредственно измерять количественные характеристики
определяемого вещества в ограниченном образце. В идеальном случае такие устройства способны работать обратимо продолжительное время и не
изменять состав исследуемого образца.
Потребность в разработке химических сенсоров (датчиков) обусловлена
многими причинами. Во-первых, сенсоры призваны хотя бы отчасти заменить собой выполнение длительных и трудоемких методик химических методов анализа. Характерным примером может служить наметившийся уход
от метода фотометрии для определения калия, натрия и кальция в крови к
использованию химических датчиков на основе ионоселективных электродов. Во-вторых, использование сенсоров неразрывано связано с автоматизацией производственных процессов. Для управления и контроля производства необходимо постоянное измерение множества химических параметров.
Наилучшим средством таких измерений непосредственно в технологическом производственном потоке являются химические сенсоры. Для использования на производстве к сенсорам предъявляется много требований. Они
должны быть надежны в эксплуатации, иметь большой срок службы и быть
устойчивы к воздействиям высоких и низких температур [1].
Разработка химических сенсоров в текущий момент является одной из
наиболее активно развивающихся областей аналитической химии. Электрохимические сенсоры представляют важный подкласс химических сенсоров, в которых электрод используется в качестве трансдуктора. Устройства такого типа занимают ведущие позиции в таких областях, как водное
хозяйство, охрана окружающей среды, служба техники безопасности, медицина, где целый ряд химических параметров требует постоянного наблюдения и контроля. Примерами самых простых задач такого рода могут
служить непрерывный контроль величины рН и мутности питьевых или
7 3
сточных вод. Как правило, для их решения используют стеклянный электрод и оптический сенсор. В области охраны окружающей среды актуальной
задачей является контроль за выбросами из дымовых труб, за содержанием
оксидов азота и серы в атмосфере, где находят применения газовые сенсоры, как оптические, так и микроэлектронные. В медицине бывает необходимо непосредственно в ходе хирургической операции постоянно контролировать соотношение калия и натрия в отдельно взятой клетке организма,
поскольку эта величина является одним из важнейших показателей общего
состояния пациента. Химические сенсоры незаменимы и для контроля за
концентрацией в организме лекарственных средств и продуктов их метаболизма, анестетиков [1].
Для создания сенсоров можно использовать явление электропроводно-
сти многих твердых тел при повышенных температурах. Особенно большое практическое значение имеют оксиды. Оксидные электроды работают
аналогично металлическим, как окислительно-восстановительные электроды, их основой служит обычно Zr O2 с добавками Ca O или Yb
O3. Сенсоры
2
на основе оксида циркония применяются для определения кислорода при
высоких температурах, например, в топочных газах или в черной металлургии. Можно использовать металлические электроды; так, в датчике Кларка
для определения кислорода используется рабочий электрод — катод из платины в паре с серебряным анодом.
В составе химических сенсоров можно выделить преобразующий эле-
мент (трансдуктор), который превращает исходную химическую информацию в электрический или оптический сигнал. Трансдуктор покрыт химически или биологически чувствительным слоем «распознавателя» веществ,
который взаимодействует с определяемым компонентом, а факт этого взаимодействия переводится в сигнал, который регистрируется устройством
фиксации и вывода данных, обычно интегрированного в корпус сенсора.
К химическим сенсорам предъявляется множество разнообразных тре-
бований, часть из которых являются общими для любых методов анализа:
чувствительность, динамический диапазон, селективность, специфичность,
временной дрейф, воспроизводимость, миниатюризация, механическая
устойчивость, время отклика, время эксплуатации, совместимость с окружающими условиями.
Наличие такого множества различных требований означает, что не мо-
жет быть единого принципа работы химического сенсора, пригодного для
всех случаев. Можно выделить следующие основные принципы действия
сенсоров:
74
• изменение электропроводности — оксидно-полупроводниковые
сенсоры на основе органических полупроводников;
• изменение потенциала — ионоселективные твердотельные газовые
электроды на основе полевых транзисторов;
• изменение силы тока — амперометрические (датчик Кларка, фер-
ментные, иммуносенсоры, зонды на основе твердых электролитов);
• изменение резонансной частоты — пьезоэлектрические весы по-
верхностно-волновые акустические;
• изменение оптических характеристик — датчики поглощения/про-
пускания, мутности, флуоресценции, показателя преломления;
• термооптические явления — фотоакустические сенсоры;
• тепловые эффекты — термические/калориметрические пеллисторы.
6.1. Электрохимические биосенсоры
Электрохимические биосенсоры сочетают аналитические возможности
электрохимических методов анализа со специфичностью процессов биологического распознавания. Основной задачей является создание электрического сигнала в биологических объектах, связанного с концентрацией определяемого компонента. Эту задачу позволяют решить биоспецифичные
реагенты, которые наносят или закрепляют на поверхности подходящего
электрода, что позволяет распознавать биологические явления по появлению амперометрического или потенциометрического сигнала. Биоэлектроды подобного рода позволяют конструировать современные аналитические
инструменты, пригодные для решения многих задач. Развитие электрохимических биосенсоров протекает в различных направлениях; два основных
различаются способами распознавания — это биокаталитические устройства (использующие ферменты, клетки или ткани как неподвижную основу) и аффинные биосенсоры (основанные на антителах, мембранных рецепторах и нуклеиновых кислотах).
6.2. Ферментные электроды
Ферменты — это молекулы белковой природы, которые катализируют
реакции в живых организмах, обладающие не только высокой эффективностью, но и исключительной селективностью. Ферментные электроды основаны на сочетании слоя фермента с подходящим электродом, в результате
чего биоэлектрод демонстрирует обширные возможности по изучению раз-
7 5
личных биологически значимых объектов в клинической, экологической и
пищевой отраслях.
Фермент на роль неподвижного слоя подбирается таким образом, что-
бы катализировать реакцию, в которой определяемый компонент является
реагентом или продуктом. Выбор электрода в первую очередь зависит от
природы фермента: например, амперометрические образцы хорошо подходят для процессов ферментативного окисления или дегидрирования,
стеклянные электроды используются для изучения ферментативных процессов, сопровождающихся изменением рН, газовые потенциометрические
электроды подходят для ферментов декарбоксилаз.
Эффективность ферментных электродов определяется посредником,
обеспечивающим тесный контакт между ферментом и поверхностью
трансдуктора и при этом поддерживающим или повышающим стабильность фермента. Существует несколько физических и химических способов закрепления фермента на поверхности электрода. Самый простой из
них — это зафиксировать раствор фермента между электродом и мембраной для диализа. Альтернативный вариант предусматривает использование
полимерных пленок, по типу нафиона или полипиррола, для связывания
фермента посредством заливки или электрополимеризации. Дополнительные улучшения могут быть реализованы сочетанием нескольких мембран или покрытий. На
рис. 22 представлены основные
этапы простого и удобного метода изготовления электрода, в
котором фермент замкнут между пленкой ацетата целлюлозы
с внутренней стороны и коллагеном или поликарбонатной
мембраной — с внешней и соединен с амперометрическим
преобразователем [10].
Сначала изготавливают элек-
трод с серебряным катодом и
небольшим платиновым анодом.
Следующим этапом на электродную поверхность наносят раствор ацетата целлюлозы, после
Рисунок 22. Этапы создания амперометрического
ферментного электрода
76
12
kk
[ ]
S
V
υ
высыхания которого образуется тонкая полимерная пленка. На этапе III в
области платинового контакта помещают каплю раствора фермента, которую
впоследствии покрывают внешней мембраной.
Мембранные покрытия помогают расширить диапазон линейности
электрода и ликвидировать наложения потенциала от других электроактивных частиц или молекул белков.
При химическом методе фиксации фермент закрепляется на поверхности ковалентным связыванием за счет посредников, таких как глутаровый
альдегид или амиды. Ковалентное связывание может сочетаться с использованием тиолатных слоев для организации многослойных ферментных
сетей на поверхности электрода. Другие подходы предусматривают фиксацию внутри тонкого слоя геля, низкотемпературное внедрение в золь-гель
пленки, адсорбцию на поверхности графита, смешивание с объемной трехмерной матрицей углеродной пасты или эпоксиграфита, а также элекрохимическое соосаждение фермента и металлических частиц.
Электрохимическое соосаждение, так же как и электрополимеризация,
хорошо подходит для локализации фермента на миниатюрных поверхностях сенсоров. Способ фиксации фермента может менять его поведение по
сравнению с гомогенным раствором; например, обычные параметры, такие
как оптимальная температура или рН, для каталитических реакций могут
существенно отличаться.
Чувствительность энзимных электродов зависит от многих параметров,
и понимание теоретических основ помогает их совершенствовать. Ферментативные реакции включают один реагент, который претерпевает превращение по следующей схеме:
E S ES E P,
+ →+
k
1
−
где Е — фермент, S — реагент (субстрат), ES — комплекс фермента и субстрата, Р — продукт ферментативной реакции, k1 — константа скорости
образования комплекса, k–1 — константа скорости разрушения комплекса,
k2 — константа скорости образования продукта. В этом механизме реагент
соединяется с ферментом и образует промежуточный комплекс, который
далее распадается на продукт и свободный фермент. В случае постоянной
концентрации фермента скорость ферментативной реакции определяется
уравнением Михаэлиса-Ментена:
m
,
K=+
( )
m
(6.1)
S
[ ]
7 7
6 12 6 2 6 10 6 2 2
22 2
HO O 2 .
где Km — константа Михаэлиса-Ментена; Vm — максимальная скорость
реакции, моль/(л · с); [S] — концентрация реагента, моль/л. При создании
энзимных электродов желательно добиваться наибольшего значения максимальной скорости и наименьшего значения Km.
Повысить чувствительность и возможности ферментного электрода
можно сочетанием двух или более ферментативных реакций. Например,
значительное улучшение чувствительности может быть достигнуто рециркуляцией определяемого вещества в двух ферментативных системах.
6.3. Применение ферментных электродов
Определение уровня глюкозы в крови играет ключевую роль в диагно-
стике и терапии сахарного диабета. Электрохимические биосенсоры для
глюкозы занимают ключевую позицию в этом направлении. Амперометрические датчики основаны на глюкозооксидазе, помещенной между полиуретаном и избирательной мембраной на платиновый рабочий электрод.
Глюкозооксидаза катализирует реакцию:
CH O O CH O ,HO+→ +
образующаяся при этом перекись водорода может быть определена амперометрически на платиновом электроде:
E
Pt
e→+
Глюкозооксидаза не может непосредственно переносить электроны к поверхности электрода, так как окружена тонким белковым слоем. Этот изолирующий слой пространственно разделяет донорно-акцепторную пару,
следовательно, является внутренним барьером для переноса электронов.
С другой стороны, использование искусственных переносчиков электронов
приводит к увеличению флуктуации кислорода и снижению потенциала на
фоне увеличения шума. Многие органические и металлорганические окислительно-восстановительные соединения рассматриваются на роль ферментных посредников. В частности, производные ферроцена успешно переносят электроны от глюкозооксидазы к электроду, при этом Fe+3 окисляет
восстановленную форму глюкозооксидазы и последовательно окисляется
на поверхности платинового электрода.
Такие электроды позволили разработать устройства для измерения со-
держания глюкозы в крови размером с шариковую ручку и проводить ана-
78
NADH NAD H 2 .e
→ ++
43
+ +−
лиз в объеме одной капли. Одноразовые полоски, используемые в таких
устройствах, сделаны из поливинилхлорида и углеродных электродов, содержащих смесь глюкозооксидазы и посредника. Другие классы многообещающих посредников для глюкозооксидазы представлены производными
хинона, комплексами рутения, феррицианидами, фенотиазинами и органическими токопроводящими солями.
Определение содержания этанола является важным в различных областях. Ферментативное окисление этанола, происходящее под действием
никотинамидадениндинуклеотида (NAD
+
) в пристутсвии алкогольдегидро-
геназы (ADH) по реакции:
ADH
CH CH OH NAD CH CH O NADH,
− −+ → −=+
32 3
+
используется при проектировании амперометрических сенсоров для этанола. Устройства, не требующие реагентов, основаны на совместной фиксации алкогольдегидрогеназы и никотинамидадениндинуклеотида на поверхности различных углеродных или платиновых анодов. Обратное окисление
NADH до NAD+ производится электрохимически, при этом проводится измерение анодного тока процесса:
++
Основной проблемой является высокое перенапряжение и непосредственное окисление NADH на электроде, поэтому большинство работ
направлены на разработку модифицированных электродов с каталитическими свойствами NADH. Редокс-посредники, такие как феноксазин или
фенотиазин, используются для многих биосенсоров на основе дегидрогеназ. Спиртовые биосенсоры могут быть реализованы на основе измерения
перекиси водорода, образующейся в присутствии алкогольоксидаз.
Определение такого физиологически важного компонента, как мочевина,
может быть основано на реакции катализируемой уреазой:
NH CONH 2H O H 2NH HCO
2 22
+ +→ +
уреаза
.
В данном случае роль сенсора выполняет ионоселективный электрод,
окруженный гелем с включенной уреазой. Образующиеся катионы аммония определяются спустя 30 – 60 с после достижения устойчивого потенциала. Другой подход предусматривает определение изменения рН с помощью стеклянного электрода. Очевидно, что для потенциометрического
эксперимента потенциал будет линейно зависим от логарифма концентрации мочевины в исследуемом растворе.
7 9
Способность ферментов изменять скорость биокаталитических реак-
ций также может быть измерена. Чувствительные пробы на органофосфатные и карбаматные пестициды, дыхательные яды — цианиды или азиды,
токсичные металлы были разработаны с использованием таких ферментов, как ацетилхолинэстераза, пероксидаза хрена или тирозиназа. Аналитическую информацию получают за счет снижения электрохимического
сигнала от соответствующего компонента, количество которого связано с
взаимодействием между ингибитором и ферментом. Определение содержания пестицидов с помощью холинэстеразы часто реализуется посредством двухферментной системы — холинэстераза/холиноксидаза, совмещенной с амперометрическим мониторингом образующихся пероксидных
частиц. По изменению сигнала можно также проводить оценку активности
ферментов.
6.4. Тканевые и бактериальные электроды
Ограниченная стабильность изолированных ферментов, а также тот
факт, что некоторые ферменты дороги и труднодоступны, послужили причинами для использования клеточных материалов (ткани растений, клетки
бактерий и т. п.) в качестве источника ферментативной активности. Например, ткань банана, богатая содержанием полифенолоксидазы, может быть
смешана с угольной пастой, что дает быстродействующий и чувствительный дофаминовый сенсор. Биоэлектроды такого типа по своим функциям
схожи с ферментными электродами. Другие полезные сенсоры основаны на
сочетании микроорганизмов и электрохимических преобразователей.
6.5. Аффинные биосенсоры
В аффинных сенсорах используется селективное связывание опреде-
ленных биомолекул (антител, рецепторов или полинуклеотидов) с специфичными частицами-мишенями. Процесс биомолекулярного распознавания управляется формой и размером полости рецептора и целевого лиганда
(аналита). Процесс связывания в такого рода процессах определяется термодинамикой — в отличие от кинетического контроля для большинства
биокаталитических систем. Высокая специфичность реакций биохимического связывания приводит к высокой селективности и чувствительности
аффинных биосенсоров. Электрохимические преобразователи хорошо подходят для обнаружения таких событий и основаны на измерении электро-
80
химического сигнала, образующегося в результате процесса связывания.
Другой тип взаимодействий — гибридизация (распознавание пар азотистых оснований по принципу комплементарности) двух комплементарных
ДНК-нитей — также может быть использован для чувствительных к последовательности ДНК сенсоров. Такое определение специфичной последовательности ДНК хотя еще и находится на стадии зарождения, но является многообещающим для диагностики инфекционных или генетических
заболеваний.
Наиболее широко описанным вариантом аффинных биосенсоров являются иммуносенсоры — устройства, основанные на иммунологических реакциях, включающих распознавание формы антигена (Ag) антителами (Ab)
за счет образования комплекса антитело-антиген (Ab Ag). Антитела — глобулярные белки, производимые организмом для связывания с инородными молекулами (антигенами), помечающие их для удаления из организма.
Примечательная избирательность антител основана на стереоспецифичном связывании с антигеном и проявляется в больших значениях констант
связывания (диапазон от 105 до 109 л/моль). Приготовление антител может
быть моноклональным или поликлональным. Электрохимические иммуносенсоры, сочетающие специфические иммунореакции с электрохимическими преобразователями, привлекают особое внимание в последние годы.
Такие сенсоры основаны на маркировке антител или антигена ферментами,
которые действуют на субстрат и производят электроактивные продукты,
которые могут быть обнаружены амперометрически.
Ферментные иммуносенсоры могут работать в конкурентом или сэндвичевом режимах. В случае конкурентного типа образец антигена соревнуется с фермент-меченным антигеном за место для связывания на
мембране амперометрического или потенциометрического сенсора. После завершения реакции сенсор промывают для удаления непрореагировавших веществ. Образец помещают в раствор субстрата фермента и
определяют продукты ферментативной реакции; измеряемый сигнал будет обратно пропорционален концентрации аналита в образце. Некоторые
ферменты, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза или каталаза, хорошо подходят для подобных задач. Сэндвичевый тип сенсоров используется для измерения крупных антигенов, которые способны связываться с
двумя различными антителами. В таких сенсорах сначала антитело связывается с аналитом-анти геном, который затем связывается с антителом, содержащим ферментную метку. После удаления неспецифически адсорбированной метки образец помещают в раствор субстрата и следят за ходом
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]