Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
Таблица 3.3
Показатель
Коровье молоко
Козье молоко
Продолжительность
латентного периода, с
18,50,03
22,2
Содержание витамина
С, мг/100мл
2,080,02
2,68
Содержание SH-групп,
мкмоль/л
150,05
480,4
Показатели антиоксидантной активности молока (Мm)
Данные ХЛ-анализа показывают, что коровье натуральное молоко в большей степени подвержено свободнорадикальному окислению, чем козье, что согласуется со спектрофотометрическими данными. Авторы объясняют результаты различным содержанием SHгрупп в молочном сырье. Эти соединения выполняют свою антиокислительную функцию за счет подвижного атома водорода. Уровень SHгрупп в козьем молоке в 3,19 раза выше, чем в коровьем) соответственно 480,4 14,0 мкмоль/л; р< 0,001) [254].
3 . 2 . Ф о т о м е т р и ч е с к и е м е т о д ы
Фотометрия основана на переводе определяемого компонента
в поглощающее свет соединение с последующим определением количества этого компонента путем измерения светопоглощения раствора
полученного соединения [256] и включает спектрофотометрию, фотоколориметрию и визуальную фотометрию, которую обычно называют
колориметрией.
Каждое вещество поглощает излучение с определенными (характерными только для него) длинами волн, т. е. длина волны поглощаемого излучения индивидуальна для каждого вещества, и на этом основан качественный анализ по светопоглощению [257].
Ниже приведены наиболее распространенные методы определения АОА, в которых детектирование сигнала осуществляется фотометрически.
Чаще использются фотометрические методы, основанные на
определении антиоксидантной активности соединений относительно
свободных экзогенных СР (ABTS, DPPH, AAPH и др.) [258].
71
Например, определение DPPH теста проводится спектрофотометрическим методом со спиртовым раствором радикала DPPH при длине
волны 517 нм. Измерения проводятся через тридцать минут и строятся
кривые зависимости % ингибирования радикалов DPPH от концентрации исходного антиоксиданта. Одним из основных показателей, характеризующих антирадикальную активность по стационарному методу
DPPH, является концентрация экстракта антиоксиданта, при которой
наблюдается 50 % ингибирование радикалов DPPH. В результате динамического процесса строятся кривые зависимости процента ингибирования радикалов DPPH в течение 120 мин [259].
Еще одним фотометрическим методом является измерение АО
активности по способности исследуемой смеси ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода [18].
Адреналин – это гормон, участвующий в регуляции многочисленных функций организма [259, 260].
Согласно химической структуре и, соответственно своим свойствам адреналин является донором электронов, и эта его функция реализуется именно в процессе хиноидного окисления. Окисление адреналина до адренохрома происходит в результате внутримолекулярных перестроек молекулы адреналина путем циклизации с образованием промежуточных продуктов, таких как радикал семихинон, адреналинхинон (рис. 3.2).
Этот процесс сопровождается, как известно, одноэлектронным
восстановлением кислорода и, таким образом, связан с образованием
супероксидных радикалов (О
-.
): высвобождающийся электрон восста-
2
навливает растворенный в среде кислород [260].
Окисление адреналина без участия ферментов происходит в щелочной среде: в бикарбонатном буфере [259]. В качестве контрольной
пробы к бикарбонатному буферу добавляют адреналин и по истечении
10 мин измеряют оптическую плотность при длине волны 347 нм в кювете толщиной 10 мм на спектрофотометре СФ-46 [252, 259]. Затем проводят измерение исследуемого раствора. Опыт повторяют несколько
раз, и величина АОА более 10 % свидетельствует о наличии антиоксидантной активности [259].
Одним из широко используемых методов определения суммарной антиоксидантной активности сложных объектов является спектроскопический метод FRAP (ferric reducing/antioxidant power), который
основан на способности антиоксидантов восстанавливать ион
72
железа(III). При фотометрическом определении железовосстанавливающей способности антиоксидантов используют индикаторные системы, в состав которых входят Fe(III) и органический реагент, который образует окрашенный комплекс с восстановленной формой железа
(Fe(II)). В качестве таких соединений применяют трипиридилтриазин
[261], гексацианоферрат калия [262], 2,2′- дипиридил, о-фенантролин
[263]. Индикаторные системы с двумя последними реагентами характеризуются более высокими значениями редокс-потенциалов (0.97 и 1.19
В соответственно), что позволяет расширить круг определяемых веществ. Выбор длины волны, при которой проводится определение
АОА, зависит от индикаторной системы.
Рис. 3.2. Образование адренохрома и его производных в процессе
автоокисления адреналина по хиноидному пути: I – адреналин;
II – адреналинсемихинон; III – адреналинхинон; IV – лейкоадренохром;
V – адренохромсемихинон; VI – адренохром; VII – адренохром
(цвиттер-ион); VIII – адренолютин; IX – адренолютин (кето-форма)
73
В литературе описан ряд спектрофотометрических методик определения АОА пищевых продуктов, основанных на окислительно- восстановительной реакции Fe(III)/Fe(II): известны методы определения
аскорбиновой кислоты по интенсивности окраски комплекса Fe(II) –
пиридил-2,6-дикарбоновая кислота [264], Fe(II) – ферроцин [265].
Методика FRAP для оценки АОА пищевых продуктов с использованием этих систем имеет удовлетворительную чувствительность.
Методика метрологически обоснована, однако, в круг определяемых
этим методом соединений не входят сульфгидрильные SH-содержащие
антиоксиданты, такие как глутатион и цистеин, поэтому получаемая
этим методом информация не дает полное представление о состоянии
антиоксидантной системы [192].
Помимо восстановления Fe3+, может быть использовано восстановление антиоксидантами Ce4+ (λ = 320 нм) – CRAC (Сeric Reducing
Antioxidant Capacity) и Cu2+ (λ=450 нм) – CUPRAC (Сupric ion Reducting
Antioxidant Capacity) [266].
Недостаточная изученность природных связей АО и трудоемкость получения многомерных градуировок препятствуют широкому
применению спектроскопических методик [14].
В последнее время для количественной оценки АОА используется также новый проточно-инжекционный метод (ПИ-метод) на основе фотометрирования жидкофазных реакций с участием двух хромоформных радикалов – 2,2’азинобис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) и 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразина. В основу создания
этого метода исследования АО была положена известная реакция их
взаимодействия с окрашенным метастабильным катион-радикалом
2,2’азинобис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АBTS+.),
представленная на рис. 3.3.
Для получения АBTS+. используется реакция жидкофазного
окисления диаммонийной соли, которая обычно занимает несколько
часов. Наибольшая скорость образования катион-радикала происходит
под действием периодат-ионов в присутствии марганца(ΙΙ) как катализатора при 40 °С и рН 7,4.
Для исследования противорадикального действия АО была разработана схема ПИА, включающая генерирование АBTS+, его реакцию
с антиоксидантом и фотометрическое детектирование оставшегося радикала в реакционной зоне [267].
В основу другого ПИ-метода положено спектрофотометрическое
детектирование триарилгидразильного радикала 2,2’-дифенил-1-
74
пекрилгидразила (ДФПГ.) в водно-этанольной среде. Молекула ДФПГ.
представляет собой свободный радикал, характеризующийся стабильностью в различных средах и в широком интервале температур, что объясняется максимальной делокализацией свободного электрона по всей молекуле и пространственным экранированием атомов, несущих наибольшую спиновую плотность, а также отсутствием атомов водорода в этом
положении, где может происходить изомеризация или диспропорционирование. Кроме того, делокализация является причиной интенсивной фиолетовой окраски этого радикала в водно-спиртовых средах.
Рис. 3.3. Реакция АО с окрашенным метастабильным
катион-радикалом 2,2’азинобис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоновой
кислоты) (АBTS+.)
При взаимодействии с антиоксидантом, способным отдавать протон, происходит восстановление этого радикала, в результате чего его
фиолетовая окраска переходит в желтую (рис. 3.4).
75
(1) (2)
Рис. 3.4. Восстановление радикала при взаимодействии
с антиоксидантом [267]
Основным недостатком данного метода является неустойчивость
ДФПГ, в частности его способность разрушаться под действием света
и кислорода [264], что требует дополнительного и частого определения
собственного поглощения ДФПГ. Последний растворим только в органических средах, обычно низших спиртах, и его светопоглощение
в значительной мере зависит от содержания воды в растворителе и исследуемом объекте [265].
Возможности ПИ-методов были продемонстрированы на примере определения антирадикальной активности и степени радикального захвата ряда низкомолекулярных АО, тролокса и растительных
АО. Они успешно используются для оценки интегральной АОА лекарственных средств и пищевых добавок.
Достоинства ПИ-методов заключаются в их высокочувствительности, широком диапазоне определяемых значений, улучшенной воспроизводимости результатов, малом объеме пробы [264].
76
Применение для оценки АОА молочной продукции. Авторы работ
[268] провели оценку фотометрического определения ТБК-активных
продуктов и общей АОА молока «Простоквашино» и «Тёма», и было
установлено, что содержание ТБК активных продуктов в детском молоке «Тёма» было выше, чем в молоке «Простоквашино» [44, 268], что
свидетельствовало о более высоком качестве молока марки «Простоквашино».
Обобщая вышеизложенный материал, можно отметить особенности, характерные для всех перечисленных выше методов:
1. Информация об АОА не является прямой, так как основана на
реакциях взаимодействия с экзогенными долгоживущими свободными
радикалами, чуждыми для живой клетки [254].
2. Многостадийность анализа и, как следствие, его высокая про-
должительность.
3. Необходимость дорогостоящих регистраторов аналитиче-
ского сигнала – спектрофотометрическое или флюорометрическое оборудование.
3 . 3 . Э л е к т р о х и м и ч е с к и е м е т о д ы
Электрохимические методы исследования основаны на изучении
и использовании процессов, протекающих на поверхности электрода
или в приэлектродном пространстве. Любой электрический параметр
(потенциал, сила тока, сопротивление и др.), функционально связанный
с концентрацией анализируемого раствора и поддающийся правильному измерению, может служить аналитическим сигналом.
Различают прямые и косвенные электрохимические методы.
В прямых методах используют зависимость силы тока (потенциала
и т. д.) от концентрации определяемого компонента. В косвенных методах силу тока (потенциал и т. д.) измеряют с целью нахождения конечной точки титрования определяемого компонента подходящим титрантом, т. е. используют зависимость измеряемого параметра от объема
титранта [257].
В настоящее время все большее число специалистов предпочитают использовать электрохимические методы определения АОА
77
объектов, считая, что электрохимические методы оценки интегральной
антиоксидантной способности более перспективны, так как взаимодей-
ствие активных кислородных соединений (
, ,
и др.)
в водной среде сопровождается передачей электрона [269].
Доноры электронов являются основными веществами, улавливающими радикалы, вызывающими обрыв цепи радикальных реакций,
разрушающими или инактивирующими сильные окислители. Очевидно, что в этом случае будет справедливо утверждение, что расходование правильно подобранного оксиданта в химической реакции окисления-восстановления дает информацию о концентрации антиоксиданта. В этой ситуации наиболее доступным источником информации
может служить измерение электрохимических параметров системы реагент/антиоксидант.
Кроме того, электрохимические методы характеризуются высокой
чувствительностью, быстротой процедуры анализа, относительно невысокой стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит и анализа в целом [270–274].
Электрохимические методы, нашедшие применение для оценки
АОА пищевых продуктов, подразделяются на потенциометрию, вольтамперометрию, кулонометрию и амперометрию.
Потенциометрические методы. Основаны на измерении разности
потенциалов индикаторного электрода и электрода сравнения или точнее электродвижущих сил (ЭДС) различных цепей, поскольку экспериментально измеряется именно ЭДС, являющаяся разностью потенциалов. Равновесный потенциал индикаторного электрода связан с активностью и концентрацией веществ, участвующих в электродном процессе, уравнением Нернста [257]. Изменения ЭДС и ЭП позволяют
определить активности либо концентрации растворенных веществ,
либо общее содержание вещества в растворе [256].
Достаточно простым и информативным является потенциометрический метод с медиаторной системой, который адаптирован к анализу широкого круга объектов. Медиатором служит система
K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] [257]. Добавление растворов, содержащих вещества, проявляющих антиоксидантную активность, в электрохимическую ячейку приводит к изменению окислительно-восстановительного
потенциала среды в результате взаимодействия антиоксидантов с окисленным компонентом (K3[Fe(CN)6]) медиаторной системы [270].
Изменение потенциала при этом происходит в результате протекания химической реакции в растворе:
78
nМеOxL + АО = nМе
Вещество
m:n
Аскорбиновая кислота
1:2
Цистеин
1:1
Глутатион
1:1
Гидрохинон
1:2
Катехол
1:2
Танин
1:10-12
Мочевая кислота
1:2
L + АОOx,
Red
где МеOxL – окисленная форма металла в составе комплексного соединения; Ме
L – восстановленная форма металла в составе комплекс-
Red
ного соединения; АО – антиоксидант; АОOx – продукт окисления антиоксиданта [276].
Этим методом установлены стехиометрические коэффициенты
реакций взаимодействия ряда природных антиоксидантов с медиаторной системой.
Данные о стехиометрических коэффициентах реакции
приведены в табл. 3.4 [277].
Как показали исследования, применение потенциометрического
метода определения антиоксидантной активности позволяет проводить
экспрессный отбор образцов виноградного вина для их дальнейшей
идентификации [278], а также дает возможность определять такие антиоксиданты, как аскорбиновая кислота, цистеин, глутатион, гидрохинон, катехол, танин, мочевая кислота [256, 270] (табл. 3.4).
Таблица 3.4
Стехиометрические коэффициенты реакции медиаторной
системы с антиоксидантами
Достоинства метода: адаптирован к условиям проточно-инжекционного анализа, предоставляет дополнительную возможность его использования непосредственно в процессе производства продуктов питания, экспрессность (время одного измерения 3–5 мин), доступность и
низкая стоимость расходных материалов, чувствителен, дает
79
возможность проводить определения в мутных и окрашенных растворах и даже в вязких пастах. Точность измерений составляет от 4 до
0,01 мВ [256].
К недостаткам потенциометрического титрования можно отнести
не всегда быстрое установление потенциала после добавления титранта
и необходимость во многих случаях проводить при титровании большое количество отсчетов [257].
Вольтамперометрический метод. Метод анализа, основанный
на расшифровке поляризационных кривых (вольтамперограмм), получаемых в электрической ячейке с поляризующимся индикаторным
электродом и неполяризующимся электродом сравнения, называют
вольтамперометрическим. Вольтамперограмма позволяет одновременно получить качественную и количественную информацию о веществах, восстанавливающихся или окисляющихся на микроэлектроде
(деполяризаторах), а также о характере электродного процесса.
В качестве поляризующегося микроэлектрода часто применяют
ртутный капельный электрод, а сам метод называют в этом случае полярографией, следуя термину, который предложил Я. Гейровский, разработавший этот метод в 1922 г. [14].
Для количественного определения АО применяют вольтамперометрию с линейной разверткой потенциала, циклическую, дифференциально-импульсную и квадратно-волновую [279].
Вольтамперометрия – один из методов анализа, который в настоящее время наиболее динамично развивается [280]. Это обусловлено
как появлением новых материалов (в том числе и композиционных),
пригодных для изготовления электродов, так и усовершенствованием
электронных схем с использованием микропроцессорной техники. При
сравнительной простоте оборудования этот метод сочетает в себе высокую абсолютную чувствительность (до десятых или сотых микрограмма элемента в литре раствора), многоэлементное определение в одной пробе, экспрессность и легкость автоматизации операций.
Кроме высокой чувствительности, не последнюю роль играет и
стоимость анализа, включающая время работы оператора на использование оборудования и расход реактивов и энергии. Немаловажную роль
играет и стоимость оборудования.
Предназначенные ранее для анализа токсичных тяжелых металлов
и некоторых органических (фенолы, серосодержащие вещества) поллютантов окружающей среды эти приборы могут быть применены и для
определения антиоксидантной активности различных соединений [281].
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]