Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
Г л а в а 4 . Г А Л Ь В А Н О С Т А Т И Ч Е С К А Я
К У Л О Н О М Е Т Р И Я Д Л Я О Ц Е Н К И И Н Т Е Г Р А Л Ь Н О Й
А Н Т И О К С И Д А Н Т Н О Й А К Т И В Н О С Т И М О Л О К А
И М О Л О Ч Н О Й П Р О Д У К Ц И И
Как было показано выше, в настоящее время для оценки антиоксидантной активности молока и молочной продукции отечественные
исследователи используют два метода: хемилюминесцентный и амперометрический.
В настоящей работе обобщены и систематизированы данные кулонометрического титрования электрогенерированным бромом по
оценке интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочных продуктов за период исследования 2008–2017 гг.
4 . 1 . М е т о д и к а о п р е д е л е н и я и н т е г р а л ь н о й
а н т и о к с и д а н т н о й а к т и в н о с т и м о л о ч н о й
п р о д у к ц и и и р е к о м е н д а ц и и п о р е а л и з а ц и и
м е т о д а в п р о и з в о д с т в е н н ы х у с л о в и я х
Измерения проводили на кулонометре «Эксперт-006» (НПК
ООО «Эконикс-Эксперт», г. Москва) с использованием метода кулонометрического титрования электрогенерированным бромом (рис. 4.1) [301].
Подготовка к выполнению измерений. При подготовке к выпол-
нению измерений должны быть проведены следующие работы: приготовление фонового раствора электролита, отбор пробы, подготовка
электродов и анализатора «Эксперт-006» к работе, для чего электродную ячейку заполняют фоновым раствором электролита.
Приготовление фонового электролита. Серную кислоту плотно-
стью 1,84 г/см3 и объемом 5,7 см3 растворяют в 500 см3 дистиллированной воды. Добавляют 23,8 г бромистого калия. Доводят объем раствора
до метки 1000 см3 дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор должен храниться в плотно закрытой полиэтиленовой посуде.
91
Рис. 4.1. Кулонометр «Эксперт-006»
Подготовка к работе кулонометра «Эксперт-006». Кулонометр
«Эксперт-006» подключают согласно «Руководству по эксплуатации».
Разъемы электродов подключают к соответствующим разъемам на задней панели анализатора. Подключают магнитную мешалку ПЭ–6100 к
соответствующему разъему «УПР» на задней панели кулонометра
«ЭКСПЕРТ-006». Заполняют кулонометрическую ячейку фоновым
раствором электролита. Помещают электроды в соответствующие
гнезда кулонометрической ячейки. Включают кулонометр.
Выполнение измерений. Электрогенерацию брома осуществляют
на кулонометре «Эксперт-006» при постоянной силе тока 55,3 мА из
водных 0,2 М растворов KBr в 0,1 M H2SO4 с определением конца титрования вольтамперометрической индикацией с двумя поляризованными электродами из инертного металла. Рабочий и вспомогательный
электроды углеситалловые, вспомогательный электрод – катод – отделен полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.
Кулонометрическое определение проводили следующим образом. Измерительный потенциал кулонометра «Эксперт-006» при включении кнопки «Изм» (подается ток в цепи анод–катод, на аноде генерируются радикалы брома) понижается до потенциала измерения, при достижении которого включается сигнал «Введите пробу». При введении
92
пробы антиоксидантные вещества быстро реагируют с радикалами
р
аликвоты
К
V
tI
ИАА=
100
брома, и потенциал возвращается на исходное значение.
С потенциала уровня уменьшения начинается отсчет времени перемешивания (которые мы задали – 100 с). За это время все антиоксиданты молока, включая их неактивные формы, успевают прореагировать, и потенциал выходит на плато. Включается сигнал измерения и
начинается отсчет времени достижения измерительного потенциала,
т. е. потенциала измерения, при этом подается ток в цепи анод–катод,
на аноде генерируются радикалы брома.
При достижении измерительного потенциала прибор выдает значение времени на дисплей прибора и заносит его в таблицу персонального компьютера.
Суммарное содержание антиоксидантной активности (ИАА) молока (мг/100 мл в пересчете на рутин [302]) определяли по формуле
,
где I – сила тока, мА; t – время достижения конечной точки титрования, с;
V
– объем аликвоты (100 мкл); Кр – коэффициент пересчета на
аликвоты
рутин (стандарта), установленный экспериментально.
При подключении к компьютеру необходимость в проведении
расчетных работ исключается. В этом случае фиксируют данные, соответствующие 3–4 близким по значению последовательным величинам
измеряемого показателя (потенциала).
Предварительно осуществляется калибровка прибора по стандартному антиоксиданту, возможно использование аскорбиновой
кислоты, рутина. Последнее предпочтительнее, так как рутин является государственным стандартным образцом.
Калибровка кулонометра осуществляется следующим образом.
Готовят спиртовый раствор рутина. Для этого точная навеска (0,05 г)
государственного стандартного образца рутина по ТУ 9369-141048668244, предварительно высушенная в течение 3 ч при 130 °С, растворяется в 85 мл этилового спирта (96 % об.) при нагревании на водяной бане (t = 50–60 °C). Полученный раствор переносят количественно
в мерную колбу на 100 мл и доводят до объема тем же растворителем.
После чего в ячейку кулонометра «Эксперт-006» вводят 100 мкл
93
раствора рутина и снимают показания прибора с последующим опреде-
Продукт
Электроды
Мембрана
Периодич-
ность
Способ
Периодич-
ность
Способ
Молоко: пастеризованное, стерилизованное
Через 3 измерения
Протирание
спиртом. В
конце смены –
промывка раствором детергента и дистилированной водой
По мере забивки пор
мембраны,
что отражается на графике кривой
титрования
Выдержка мембраны в концентрированной азотной кислоте в течение 30 мин с последующей тщательной промывкой дистиллированной водой.
В конце смены –
повторная операция промывки кислотой
лением поправочного коэффициента:
Q=Qп/Qд,
где Qп – показания кулонометра; Qд – концентрация рутина в калибровочном растворе
Рекомендации по реализации метода в производственных условиях. Как показали исследования, особенностью поточных измерений
ИАА молока и кисломолочных продуктов, что характерно для производственных условий, является обязательная периодическая промывка
(регенерация) электродов и мембраны для восстановления их работоспособности. Наблюдаемое «засорение», очевидно, связано с осаждением белков и продуктов их поликонденсации в результате деструктуризации всех фракций молока при титровании электрогенерированным
бромом.
Периодичность обработки комплектующих зависит от контролируемой продукции, частота обработки изменяется в ряду: молоко кис-
ломолочный продукт высокой жирности кисломолочный продукт
низкой жирности.
Условия обработки обобщены в табл. 4.1.
Таблица 4.1
Условия обработки комплектующих кулонометра
94
Окончание табл. 4.1
Кисломолочные
продукты
Через 10–
15 проб, по
мере образования налета
(пленки)
Протирание
спиртом.
В конце смены –
промывка раствором детергента и дистилированной водой
1 раз в смену
В конце смены
промывка кислотой
4 . 2 . Э к с п е р и м е н т а л ь н о е п о д т в е р ж д е н и е
п е р с п е к т и в н о с т и п р и м е н е н и я м е т о д а
к у л о н о м е т р и ч е с к о г о т и т р о в а н и я
э л е к т р о г е н е р и р о в а н н ы м б р о м о м на п р а к т и к е
При проведении аналитических работ в качестве стандарта был
использован раствор рутина (0,05 г на 100 мл).
4 . 2 . 1 . С т а д и я пр и ем к и м о ло к а
тель (ИАА), изначально позволит целенаправленно осуществлять отбор молочного сырья с высоким содержанием антиоксидантов различной природы для выпуска молочной продукции, отвечающей требованиям продукции функционального назначения.
физиолого-биохимических и зоотехнических факторов – возраст, рацион
и условия приема пищи, сезонность, условия содержания и др. [21], и ее
величина зависит от их совокупного действия.
мента возможно выявление значимости того или иного фактора. Так, для
сельскохозяйственных животных возраста, отвечающего срокам их хозяйственного использования [303], независимо от сезонности, прослеживается более высокое содержание антиоксидантов в натуральном молоке
при аналогичных условиях их содержания [1, 2] (рис. 4.2).
Ранжирование принимаемого молока, включая данный показа-
Не вызывает сомнения, что на АОА молочного сырья влияет ряд
Тем не менее при определенных условиях проведения экспери-
95
0
2
4
6
8
10
12
14
2 3 4 5 6 7
ИАА, мг/100 мл*10
возраст животного, лет
y = 0,3073x2- 4,0824x + 18,77
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8
ИАА, мг/100 мл*10
возраст животного, лет
Рис. 4.2. Влияние возраста животного на интегральную
антиоксидантную активность козьего молока казеинового типа
а
б
96
4 . 2 . 2 . С т а д ия п а с те р и за ц ии мо л о ка
На основании серии экспериментальных исследований была получена информация об интенсивности развития деструкционных процессов в коровьем и козьем молоке в зависимости от режима пастеризации, что позволило выбрать оптимальный режим термообработки,
обеспечивающий санитарно-гигиеническую надежность и максимально возможную сохранность нативных антиоксидантов молока
[304–308]. Согласно полученным данным, практически во всех случаях
наблюдалось достоверное повышение ИАА антиоксидантной системы
молока. Для выявления закономерности влияния взаимного действия
термо- и временного факторов на исследуемый показатель абсолютные
значения ИАА молока после тепловой обработки были соотнесены с
антиоксидантной активностью исходного молока в каждом опыте.
Оценка изменения величины интегральной антиоксидантной активности в относительных единицах диктовалась необходимостью корректного сопоставления полученных результатов ввиду их большого разброса, связанного с индивидуальными особенностями животного и
условиями его содержания.
Независимо от возраста КРС, для всех доноров были установлены однотипные кривые, описывающие влияние режимов пастеризации на ИАА молока, что наглядно демонстрирует графический материал, приведенный на рис. 4.3, где 1 – исходное молоко; 2 – 65 °С,
30 мин; 3 – 76 °С, 5 мин; 4 – 90 °С, 20 с; 5 – 95 °С, 5 мин.
Наблюдаемый рост интегральной антиоксидантной активности,
очевидно, отражает взаимное действие де- и реструктаризационных процессов, протекающих при пастеризации молока. С одной стороны, рост
ИАА молока при тепловой обработке может быть обусловлен повышением доступности сульфгидрильных и других боковых групп белков молока в результате их денатурации [44] и образованием новых полипептидов и свободных аминокислот при глубокой термодеструкции белковых
фракций, обладающих антиоксидантными свойствами [44, 48, 309, 310].
Данную группу соединений следует рассматривать как неспецифический
компонент антиоксидантной системы молока. Защитный эффект таких антиоксидантов основан на том, что в результате их окисления активными
формами кислорода образуются промежуточные радикалы и молекулы,
отличающиеся низкой химической активностью [311].
97
90
110
130
150
1 2 3 4 5
ИАА, %
номер режима пастеризации
90
110
130
150
1 2 3 4 5
ИАА,%
номер режима пастеризации
90
110
130
150
1 2 3 4 5
ИАА, %
номер режима пастеризации
90
110
130
150
1 2 3 4 5
ИАА, %
номер режима пастеризации
а б
в г
Рис. 4.3. Влияние режимов термообработки молока
на его интегральную антиоксидантную активность:
а, б, в, г – различные доноры;
до кормления; после кормления
Кроме того, увеличение антиоксидантной активности можно объяснить высвобождением в плазму молока ряда важнейших антиоксидантов, связанных с жировыми шариками. Изменение дисперсности
липидной фракции молока с последующим разрушением оболочек жировых шариков при различных воздействиях, включая термофактор,
является установленным фактом [312, 313].
Однако в литературе, в отличие от наших исследований, показано
снижение антиоксидантной активности молока при его термообработке
[314] при оценке уровня антиоксидантной активности химическим методом [309], практически дающим информацию только о содержании
продуктов перекисного окисления липидов [254,314]. Действительно,
наиболее уязвимой составляющей молока является его липидная фракция, которая в первую очередь подвергается действию активных форм
кислорода, присутствующих в молоке, приводящему к интенсивному
свободнорадикальному окислению ненасыщенных жирных кислот с
образованием перокси-радикалов [11, 13, 44, 316] с последующим
98
ингибированием ими нативных антиоксидантов молока [11, 317], что и
фиксирует хемилюминесцентный метод.
Использование в настоящей работе метода кулонометрического
титрования электрогенерированным бромом, способного вступать в радикальные окислительно-восстановительные реакции электрофильного
замещения, позволяет расширить спектр измеряемых соединений, способных обладать антиоксидантными свойствами, и получить более полные данные по интегральной антиоксидантной активности молока [318].
Анализ представленного материала позволил выявить оптимальный режим термообработки (76 °С, 5 мин), обеспечивающий максимально возможную сохранность ключевых биологически активных
компонентов молока.
Вышеизложенный данные служат подтверждением возможности
использования предлагаемого метода анализа для скрининга оптимального способа термообработки молока.
4 . 2 . 3 . С р а в н и т ел ь ны й мо н ит о р ин г к а ч е с т в а
к и с л о м о л оч н ых п ро д у кт о в р а зл и чн ы х
п р о и з в о д ит е ле й
При оценке возможности применения в молочной промышленности метода кулонометрического титрования был исследован достаточно большой ряд образцов молочной и кисломолочной продукции
(табл. 4.2–4.4).
Согласно табличным данным, продукция ЗМК (независимо от
жирности) характеризуется более высоким содержанием нативных
биологически активных веществ, проявляющих противоокислительные
свойства. Интегральная концентрация антиоксидантов, сохранившихся
после тепловой обработки, в образцах молока двух других предприятий
была практически одинакова.
Наблюдается значительный разброс величин интегральной антиоксидантной активности, что с большой вероятностью связано с качеством перерабатываемого нативного молока [319]. Такой широкий диапазон значений, возможно, также обусловлен различными режимами
обработки сырья, применением разного качества закваски и ее
99
количеством и из какого сырья готовится продукт (цельное, сухое,
Производитель
ОАО «Зеленодольский молочноперерабатыва-
ющий комби-
нат» (ЗМК)
ООО «Казан-
ский молочный
комбинат»:
«Просто
молоко»
ОАО «Компания
ЮНИМИЛК-
DANONE»
(Ю-D)
ИАА, мг/100мл
128,5
123,75
124,8
Производитель
ОАО «Зеленодольский молочноперерабатыва-
ющий комби-
нат» (ЗМК)
ООО «Казан-
ский молочный
комбинат»:
«Просто
молоко»
ОАО «Компания
ЮНИМИЛК-
DANONE»
(Ю-D)
Диапазон ИАА,
мг/100 мл
92,10–129,23
99,21–117,13
74,19–116,38
Среднее,
мг/100 мл
115,05
109,2
98,41
обезжиренное молоко).
Наибольшей ИАА по усредненным данным обладает кефир, выпус-
каемый ОАО «Зеленодольский молочноперербатывающий комбинат».
Среди топленого молока лидирует продукция, выпускаемая
ОАО «Зеленодольский молочноперербатывающий комбинат». Среди
йогуртов лучшие характеристики присущи продукции ОАО «Компания
ЮНИМИЛК-DANONE»
Аналогичные исследования были проведены в отношении кисломолочных продуктов, полученных на основе заквасок, содержащих
ацидофильные палочки и бифидобактерии.
Таблица 4.2
ИАА пастеризованного молока различных производителей
Таблица 4.3
ИАА кефира различных производителей
Среди исследованных продуктов наиболее конкурентоспособны
«Бифидок» (ОАО «Зеленодольский молочный комбинат») и «Актимель» (ОАО «Компания ЮНИМИЛК-DANONE»), тем не менее последний существенно уступает первому образцу.
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]