Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
Наряду с фенольными антиоксидантами важную роль в защите организма играют легкоокисляющиеся пептиды, в состав которых входят
SH-содержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин (рис. 1.2).
1 2 3
Рис. 1.2. Структурные формулы цистина (1); цистеина (2);
метионина (3)
Как показано в экспериментальных исследованиях, при наличии
в среде SH-содержащих соединений они подвергаются окислению
в первую очередь, что предохраняет от окисления другие функциональные группы и молекулы. По некоторым оценкам, на белки, прежде
всего SH-содержащие, приходится более 50 % ингибирования синглетного кислорода в плазме [26], процессов ПОЛ в сыворотке [27] и связывания НОСl [28]. SH-содержащие соединения также могут вовлекаться в ферментативное восстановление фенольных антиоксидантов,
в частности витамина Е. Механизм действия следующий. При различных стрессовых воздействиях и патологических состояниях наблюдается обратимая окислительная модификация SH-групп, приводящая
к увеличению количества дисульфидных связей, что является неспецифической реакцией организма на экстремальное воздействие [29, 30].
Такая модификация изменяет состояние клеточных мембран, их проницаемость и адгезивные свойства, влияет на активность ферментов и
клеточную пролиферацию [30, 31], вызывает нарушения структуры цитоскелета, способствует высвобождению цинка из металлотионеинов.
Поэтому соотношение восстановленных и окисленных SH-групп и их
способность к окислительной модификации (буферная емкость) являются важными критериями неспецифической резистентности организма [13].
Важным компонентом антиоксидантной защиты организма [32]
являются хелатные соединения, связывающие ионы металлов переменной валентности и тем самым препятствующие их вовлечению в реакции разложения перекисей, так как в присутствии металлов переменной
валентности усиливается образование высокореакционных гидроксильного и алкоксильного радикалов:
11
Н2О2 + Меn+ → ОН + ОН- + Ме
(n+1)+
,
ROOH + Меn+ → RO + ОН- + Ме
(n+1)+
.
Считается, что хелаторы являются главными в защите от окисления сывороточных белков и клеточных рецепторов, так как в межклеточных жидкостях отсутствует или значительно ослаблено ферментативное разложение перекисей, хорошо проникающих через клеточные
мембраны [13].
К эффективным хелаторам ионов железа относится трансферрин,
который также может связывать катионы других металлов: Cr3+, Mn3+,
Co3+, Cu2+.
Г л а в а 2 . А Н Т И О К С И Д А Н Т Н А Я С И С Т Е М А
МОЛОКА
Согласно многочисленным работам последних лет, состояние антиоксидантной недостаточности (так называемая свободнорадикальная
патология, или синдром пероксидации) способствует развитию различных заболеваний (лучевая болезнь, атеросклероз, ишемическая болезнь
сердца и мозга, некоторые злокачественные новообразования, профессиональные и алиментарные заболевания, бронхиальная астма, отравления и др.) [11, 33–39]. И сегодня не вызывает сомнения необходимость повышения антиоксидантной активности продуктов питания с
целью уменьшения опасности загрязнения внутренней среды организма вредными для здоровья химическими агентами и противодействовия их неблагоприятному влиянию на человека.
Этим требованиям в полной мере отвечает молочное сырье, являяющееся уникальным продуктом питания, отличающимся высокой пищевой и биологической ценностью [40–43], которое содержит все необходимые для человека питательные вещества (белки, липиды, углеводы, минеральные вещества, витамины и пр.) в хорошо сбалансированных соотношениях и в легкоперевариваемой форме [44], а многокомпонентная, наиболее богатая среди природных продуктов питания
антиоксидантная система молока способствует сохранению здоровья,
гармоничному развитию, высокоактивному образу жизни людей разного возраста, повышает устойчивость к различным инфекциям и неблагоприятным факторам внешней среды (рис. 2.1).
2 . 1 . А н т и о к с и д а н т ы б е л к о в о й п р и р о д ы
В молоке содержится от 2,9 до 4 % белков, имеющих сложный
состав, отличающихся по строению, физико-химическим свойствам и
биологическим функциям. Их подразделяют на три группы. Основная
(по содержанию) состоит из четырех фракций казеина (
,
, β и χ) и
их фрагментов. Вторая – из сывороточных белков, включая β-лактоглобулин, а также минорные белки, в том числе лактоферрин. К третьей
группе относят белки оболочек жировых шариков, составляющие всего
около 1 % всех белков молока [45].
13
Рис. 3.1. Основные компоненты антиоксидантной системы молока
Согласно литературным данным [46], в целом белки способны к
неспецифической нейтрализации АФК, но менее эффективно, чем классические антиоксиданты. Однако необходимо учитывать, что обычно совокупная концентрация белков значительно выше по сравнению с последними. При воздействии АФК происходит модификация белков, и,
как было показано, инактивация АФК неизмененными по структуре белками значительно слабее, чем белками с нарушенной структурой или эквивалентными концентрациями составляющих их аминокислот [47].
2 . 1 . 1 . К а з е и н о в а я ф р ак ц ия м ол о к а
Содержание казеина в молоке колеблется от 2,1 до 2,9 %. Он содержит несколько фракций, отличающихся аминокислотным составом,
отношением к ионам кальция и сычужному ферменту. В молоке казеин
находится в виде специфических частиц, или мицелл, представляющих
собой комплексы фракций казеина с коллоидным фосфатом кальция
[44], имеющих молекулярную массу 19 000–25 000, генетически
14
изменчивые варианты, отличающиеся друг от друга заменой одного
или двух аминокислотных остатков в полипептидной цепи [48].
Кроме того, в молоке содержатся производные, или фрагменты
главных фракций казеина, которые образуются в результате расщепления последних под действием протеолитических ферментов молока.
Так, известные -казеины являются фрагментами -казеина [44].
Проведенные исследования показали возможность проявления казеиновыми фракциями антиоксидантных свойств в процессах перекисного окисления липидов. Механизм действия носит сложный характер и
связан с изменением в биосистеме Fe2+/Fe3+ равновесия [49] и ингибированием тем самым образования кислородных радикалов [50–53].
2 . 1 . 2 . С ы в о р о т оч н ые б ел к и
Под термином «сывороточные белки» обычно принято понимать
белки молока, которые остаются в его плазме после осаждения казеина
при рН 4,6–4,7 [10]. К ним относятся β-лактоглобуллин и α-лактальбумин, минорные белки – альбумин сыворотки крови, иммуноглобулины,
лактоферрин [48].
α-Лактальбумин (α-Ла). В количественном отношении α-лактальбумин является вторым белком сыворотки: его содержание составляет 0,1–0,2 %. Это компактный глобулярный белок [54]. Имеет молекулярную массу около 14000, его молекула представляет собой одну
полипептидную цепь, состоящую из 123 аминокислотных остатков и
содержащую четыре дисульфидные связи (– S–S-связи) [55]. α-Ла богат
лизином, лейцином, треонином, триптофаном и цистеином [10].
Остатки цистеина и метионина в белках особенно чувствительны
к окислению всеми активными формами кислорода, азота, серы и
хлора. В то же время, в отличие от окисления остатков остальных аминокислот, окисленные формы цистеина и метионина могут быть восстановлены. Данные процессы обеспечиваются специальными ферментными системами. Именно названная особенность – циклическое
окисление–восстановление – составляет основу их функционирования
в качестве регуляторов клеточных процессов или в качестве антиоксидантов. В ходе окисления цистеинового остатка последовательно образуются производные сульфеновой, сульфиновой и сульфоновой кислот.
15
Сульфеновые производные могут либо окисляться дальше до сульфиновых, либо образовывать смешанные эфиры с цистеином или глутатионом. Сульфеновые производные могут также восстанавливаться до
цистеина неферментативным или ферментативным путем под действием глутатионспецифической тиолтрансферазы – глутаредоксина.
Полагают, что образование смешанных эфиров сульфеновой кислоты с
глутатионом может препятствовать дальнейшему необратимому окислению серы. Примеры некоторых реакций с участием остатка цистеина
представлены на схемах 1–4 [54].
, (1)
, (2)
, (3)
, (4)
Образованное дисульфидное производное (1) далее в результате
реакции глутатион-дисульфидного обмена (2, 3) превращается в исходные формы цистеинсодержащих пептидов. Конечными продуктами
превращений (1–3) являются вода и окисленный глутатион. Для продолжения функционирования системы необходимо ее «перезарядить» – возобновить запасы восстановленного глутатиона. Эту реакцию (4) за счет восстановительных эквивалентов NADPН катализирует
фермент глутатионредуктаза. То есть, с одной стороны, серосодержащие аминокислотные остатки легко окисляются, а с другой – возможно
их восстановление до исходной формы. Названные свойства делают их
пригодными для выполнения функции «встроенных» в белки антиоксидантов [56, 57].
β-Лактоглобулин (β-Лг). Является наиболее важным в количе-
ственном отношении сывороточным белком [10, 54]. Он составляет 50–
54 % белков сыворотки (или 7–12 % всех белков молока) [55].
Молекула β-Лг состоит из 162 аминокислотных остатков и имеет
молекулярную массу около 18 300 Да. В молоке β-Лг находится в виде
димера. Белок имеет две дисульфидные связи, соединяющие остатки
цистеина в положениях 66 и 160 и 106 и 119 (или 106 и 121) и одну
свободную сульфгидрильную группу у остатка цистеина в положении
121 (или 119) [58, 59]. Это касается коровьего молока. Интересно
16
отметить, что β-лактоглобулин коровьего и козьего молока отличаются
Группа иммуноглобулинов
Молекулярная
масса, кД
Массовая доля, %
в молоке
в молозиве
IgG1
146–162
0,03–0,06
1.5–18,0
IgG2
146–154
0,006–0,012
0,1–0,3
IgG (общее количество)
0,015–0,08
2,0 – 20,0
IgА
385–430
0,005–0,01
0,1–0,6
IgМ
900
0,004–0,01
0,3–0,9
высокой степенью гомологии, которая составляет около 97 %. Имеющиеся аминокислотные замены в основном не затрагивают гидрофобного ядра рассматриваемых белков и, вероятно, не оказывают существенного влияния на их вторичную и третичную структуру. Детальное
рассмотрение аминокислотных замен показало, что в молекуле козьего
β-лг перечисленные замены могут привести к тому, что козий β-лг будет обладать более положительным суммарным зарядом по сравнению
с коровьим, что подтверждается результатами нативного электрофореза. Однако биологическая роль β-ЛГ окончательно не выяснена.
Предполагают, что он участвует в транспорте ряда веществ, например
витамина А [54].
Иммуноглобулины. Иммуноглобулины – основные защитные
белки организма, так как обладают свойствами антител – веществ, образующихся в организме при введении в него различных чужеродных
белков (антигенов) и нейтрализующих их [60].
Иммуноглобулины молока обладают резко выраженными свойствами агглютининов (от лат. Agglutinare – приклеивать) – веществ, вызывающих склеивание и выпадение в осадок микробов и других клеточных элементов [45].
Из пяти известных классов иммуноглобулинов (антител) человека в молоке найдено четыре – IgG, IgA, IgM и IgE. В обычном молоке
иммуноглобулинов содержится мало, в молозиве они составляют основную массу (до 90 %) сывороточных белков. Все иммуноглобулины
содержатся в сыворотке крови животных, откуда переходят в молоко,
за исключением секреторного иммуноглобулина А, который строится
в клетках молочной железы [48]. Содержание иммуноглобулинов в молоке и молозиве представлено в табл. 2.1.
Таблица 2.1
Иммуноглобулины молока [60]
17
Молекулы иммуноглобулинов молока представляют собой мономеры или полимеры, построенные из одинаковых структурных единиц,
или субъединиц. Каждая субъединица состоит из двух легких (L) и двух
тяжелых (Н) полипептидных цепей, ковалентно связанных дисульфидными связями. Молекулярная масса легких цепей составляет 20 000–
25 000, тяжелых – 50 000–70 000. Антигенсвязывающие центры (специфические участки) расположены в области молекулы, которая заключает в себе L-цепь и N-концевую половину Н-цепи (рис. 2.2).
Рис.2.2. Структура иммуноглобулина G
Иммуноглобулины являются гликопротеидами – к тяжелым цепям
субъединиц присоединены олигосахариды, состоящие из остатков гексоз
(маннозы, галактозы, фукозы), гексозаминов и сиаловой кислоты. Содержание углеводов составляет 2–3 % в IgG и 10–12 % в IgA и IgM.
Иммуноглобулин G является основным классом иммуноглобулинов (антител) крови человека, коров, а также коровьего молока.
Антиоксидантный механизм действия иммуноглобулинов обусловлен наличием в их молекуле легкоокисляемых тиоловых групп.
Так, установлено, что образующиеся в результате катаболического распада иммуноглобулинов и клеточных рецепторов пролин-богатые олигопептиды с аминоконцевым остатком цистеина могут выступать
в роли пептидных псевдоэнзимов – ловушек О
-
[10, 13].
2
Лактоферрин. Впервые лактоферрин (ЛФ) коровьего молока был
описан в 1939 году [61], а в 1991 году была расшифрована его первичная структура [62].
Лактоферрин (ЛФ, также известный как лактотрансферрин) – негемовый железосвязывающий гликопротеин, относящийся к семейству
трансферринов (ТФ) [63]. Углеводный компонент всех ЛФ содержит
полисахариды N-ацетиллактозаминного типа, α, 1-6 фукозилированные
18
по остатку N-ацетилглюкозамина, соединенному с полипептидной цепью [64–67]. Этот белок состоит из одной полипептидной цепи с MМ
~ 80 кДа. По данным разных авторов, этот гликопротеид имеет MМ ~
76 кДа [69, 69], 80–90 кДа [70], что, вероятно, связано с различными его
изоформами [71–74].
Главной функцией лактоферрина является транспорт железа [10].
Он образует с железом комплекс красного цвета, что и было отражено
в его названии – red protein – красный белок [75, 76]. Каждая молекула
ЛФ прочно связывает два иона Fe3+. Образование комплекса с ионами
Fe3+ идет в присутствии бикарбонатных ионов [75, 77]:
2Fe3+ + 2HCO
–
+ ЛФ(H3)2 → ЛФFe2(HCO3)2 + 6H+.
3
Ионы железа катализируют в организме реакции, приводящие к
образованию очень реакционного гидроксильного радикала:
+
= +
___________________________________
+
В отсутствие железа или других катализаторов эта реакция протекает с очень низкой скоростью [63, 78]. in vivo практически все железо
находится в связанном с белками виде. В зависимости от способности
связывать железо эти белки могут выступать в качестве катализаторов
или ингибиторов образования гидроксильного радикала. Показано, что
ЛФ препятствует образованию свободных гидроксильных радикалов
[78] и, таким образом, ингибирует перекисное окисление липидов [79],
что обеспечивается за счет связывания белком железа [63]. Позже было
показано, что ЛФ может подавлять перекисное окисление липидов (образование малонового диальдегида), связывая железо участками молекулы, отличными от активных центров. Неспецифическим связыванием
металла может быть объяснено антиоксидантное действие ЛФ при молярном соотношении железо: белок выше, чем 2:1 [80].
Исследования последних лет показали, что антиоксидантное действие ЛФ проявляется также в активации ферментов антиокислительной системы [81]. Кроме того, лактоферрину присущи другие ферментативные активности, включая ДНК-азную, РНК-азную, фосфатазную,
19
АТФ-азную и амилазную. Это вносит дополнительный вклад в выполнение им защитных функций [82, 83].
Еще одним преимуществом лактоферрина перед другими белками – антиоксидантами (каталаза, лактопероксидаза, альбумин) является нарастание антирадикальных свойств при дезамидировании и автофрагментации с образованием пептидных составляющих, которые
могут самостоятельно проявлять антиокислительные свойства [84].
Увеличение антиоксидантной активности при дезамидировании и
фрагментации может играть биологическую роль: антиоксидантное
действие этого белка может усиливаться при частичной деструкции
в желудочно-кишечном тракте ребенка. Пептиды с антиоксидантными
действиями, возникающие из лактоферрина молока, могут быть важным элементом антирадикальной защиты в первые дни жизни, когда
собственные антиоксидантные системы ребенка еще не полностью
сформированы, а его организм подвергается окислительному стрессу
вследствие непосредственного контакта с кислородом [85].
Лактоферрин обладает иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами, что обусловлено его способностью хелатировать ионы переходных металлов [86, 87]. К функциям, в основе которых
предположительно лежит комплексообразующая способность ЛФ, относят бактериостатическое, бактерицидное, фунгицидное, противовирусое, детоксицирующее действие, а также транспортную функцию [88].
ЛФ проявляет антибактериальную активность по отношению
к грамположительным, грамотрицательным бактериям и к некоторым
актиномицетам. ЛФ оказывает бактериостатическое действие посредством [89, 90] связывания ионов железа и других металлов переменной
валентности из среды поверхностных структур оболочек микроорганизмов, лишая последних жизненно-важных микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз и супероксиддисмутаз, а также снижая их резистентность к токсическому
действию химических реактивных производных кислорода [91].
Бактерицидное действие лактоферрина обусловлено прямым взаимодействием белковой молекулы с поверхностью бактерий.
В 1988 году было показано [90], что ЛФ повреждает внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий посредством связывания с липидом липополисахарида (рис. 2.3). Положительно заряженный N-конец
белка препятствует взаимодействию липополисахарида с катионами
бактериальной мембраны, вызывая высвобождение ли-
пида А с последующим повреждением мембраны и гибелью бактерии.
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]