Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
Взаимодействие ЛФ с липополисахаридом, кроме того, усиливает действие таких природных антибактериальных агентов, как лизоцим [89].
Действие ЛФ против грамположительных бактерий основано на связывании положительно заряженного белка с анионными молекулами бактериальной поверхности, такими как липотейхоевая кислота. В результате отрицательный заряд клеточной стенки уменьшается, способствуя
взаимодействию лизоцима с пептидогликаном и расщеплению последнего [63].
Рис. 2.3. Механизм антибактериального действия ЛФ
Лактоферрин синтезируется в клетках молочной железы, его содержание в коровьем молоке колеблется от 0,02 до 0,35 мг/см3 (в женском молоке его количество выше и составляет 2–4 мг/см3), резко повышается при мастите, а также в начале и конце лактации (молозиво и
стародойное молоко содержат соответственно в 10–15 и 10 раз больше
лактоферрина, чем нормальное молоко) [48].
2 . 1 . 3 . Ф е р м е н т ы
Среди антиоксидантов-белков молока наиболее важную роль играют ферменты молочного сырья.
В молоке, полученном при нормальных условиях от здорового
животного, содержится около 100 ферментов различного происхождения (оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы и
21
гидролазы), из которых исследователями выделено и идентифициро-
Гидролазы
Ферменты
других
классов
Лактозосинтаза
Каталазы
Перокси-
дазы
Оксидазы
Оксидо-
редуктазы
Ксантиноксидаза
Аскорбатоксидаза и др.
Алкагольдегидрогеназа и
др.
Лактатдегидрогеназа
Липазы
Фосфатазы
Протеазы
Лактаза
Амилаза
Лизоцим
Дегидро-
геназы
вано более 20 истинных, или нативных, ферментов [44].
Наряду с наличием нативных энзимов в молоке присутствуют эндогенные ферменты, продуцируемые молочной микрофлорой. Большая
часть нативных ферментов являются нормальными компонентами секреторных клеток, которые участвуют в клеточном метаболизме и синтезе составных частей молока и затем переходят в молоко при повреждении клеток во время процесса секреции [10, 48]. Микробные ферменты
попадают в молоко как продукты жизнедеятельности микроорганизмов,
естественно обсеменяющих молочную железу, либо как продукты жизнедеятельности микроорганизмов, переходящих в молоко в процессе
его получения и хранения.
Местонахождение нативных ферментов в молоке различно:
около 10 ферментов находятся в водной фазе, в свободном виде; около
15 связаны с мицеллами казеина и реже – с сывороточными белками и
около 30 ферментов связаны с оболочками шариков жира молока. Некоторые ферменты находятся одновременно как в белковой, так и в жировой фазах молока.
Содержание обнаруженных в молоке ферментов невелико и колеблется в пределах от нескольких микрограммов до нескольких миллиграммов в 100 мл [48].
Состав нативных и микробных ферментов молока представлен на
рис. 2.4 [45].
Рис. 2.4. Классификация ферментов молока
22
Основу природного защитного комплекса молока составляют такие биологически значимые ферменты, как лактопероксидаза, каталаза,
лизоцим, церулоплазмин, панкреатическая рибонуклеаза А и Б, ангиогенин и др. [92–94].
Эти ферменты обладают антиоксидантными, антимикробными,
иммуномодулирующими, противовоспалительными, противомутагенными свойствами [10], выполняют не только каталитические функции
при реализации противоокислительных свойств тех или иных защитных веществ, но и обеспечивают прямое обезвреживание интермедиатов кислорода и озона. Они сводят к минимуму концентрацию супероксидного радикала (
лорода (
) в клетке и резко уменьшают образование наиболее ток-
, перекиси водорода и синглетного кис-
сичного гидроксильного радикала (ОН•) [11].
Супероксиддисмутаза (СОД). Данный фермент относится к окси-
геназам, является металлопротеидом. Молекула СОД состоит из двух
подобных полипептидов, каждый из которых содержит по два атома
цинка и меди [95].
Ее особое положение в ферментной системе молока связано с катализом реакции дисмутации путем восстановления супероксидных радикалов (), предотвращая окисление липидов и других компонентов молока [24, 92]:
Источником супероксид-аниона (
↔
+ 2
в молоке являются реак-
ции, катализуемые, например, ксантиоксидазой, пероксидазой, β-D-галактозидазой, а также реакции одновалентного восстановления кислорода рибофлавином [50] и не только. В механизме его антиокислительного эффекта необходимо учитывать также способность ограничивать
окисление Fe2+ в Fe3+ и тем самым ослаблять процессы свободнорадикального окисления (СРО), для которых необходимы ионы негемового
железа [96]. Катализируя окисление Fe2+ до Fe3+, фермент поддерживает соотношение Fe2+:О2 равным 4:1, обеспечивая четырехэлектронный перенос на О2 с образованной воды и предотвращая неферментативную реакцию, в результате которой образуется О
•-
:
2
Fe
2+ +
О2 → Fe3+ + О
•-
.
2
23
Окисляя Fe2+ до Fe3+, ЦП может препятствовать реакции Фентона – образованию OH• радикалов при взаимодействии Fe2+ c H2O2:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH• + OH-,
Активными продуцентами супероксиддисмутазы являются бифидо- и молочнокислые бактерии [25].
Наличие в молоке пероксид-дисмутазы, как фермента с высокой
активностью, имеет важное значение для степени и направления развития окислительных процессов в молоке, поскольку она регулирует концентрацию пероксид-анионов [92].
Каталаза. Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы [44]. Ее количество минимально в молоке, полученном
от здоровых животных и резко возрастает в молозиве и в молоке, полученном от больных животных [10].
Каталаза представляет собой гемовый фермент, т. е. является железосодержащим ферментом, который использует гидропероксид в качестве субстрата-окислителя (для собственной трансформации в
редокс-состояние). Молекулярная масса каталазы около 250 кДа.
По структуре это – тетрамер, содержащий по одной прочно связанной
гемовой простетической группе на субъединицу [97] (рис. 2.5).
Рис. 2.5. Простетическая группа
Каталаза имеет жизненно важное значение, поскольку участвует
в биохимическом механизме поддержания нормального уровня обмена
перекиси водорода, которая из-за своей токсичности не должна накапливаться в организме. Благодаря этому она и проявляет антиоксидантные свойства [96].
Структурная организация активного центра таких ферментов (каталазы и геминовых пероксидаз) обеспечивает возможность реализации механизма двухэлектронного переноса. Благодаря этому предотвращается возможность одноэлектронного восстановления молекулы
Н2О2 с образованием гидроксильного радикала. Так, в присутствии
24
каталазы разложение Н2О2 может осуществляться посредством двух реакций:
Однако при наличии ионов металла в низкой степени окисления
(например, у гемоглобина) всегда существует риск образования гидроксильного радикала [98].
Для каталазы характерны и проаксидантные свойства: она может
выступать источником образования АФК: около 0,5 % кислорода, образующегося при разложении Н2О2, возникает в возбужденном синглетном состоянии (39). Каталаза относится к ферментам, которые
наиболее длительно сохраняют свою высокую активность, почти не
требуют энергии активации, скорость реакции этого энзима лимитируется лишь скоростью диффузии субстрата к активному центру. Из-за
большой молекулярной массы каталаза плохо проникает внутрь клеток,
а во внеклеточных жидкостях быстро теряет свою активность в результате действия протеолитических ферментов [11, 13].
Пероксидазы. В антиоксидантной системе молока существенную
роль играют пероксиды, которые используют перекись водорода в качестве акцептора кислорода.
Лактопероксидаза и миелопероксидаза, составляющие 1/3 общей
пероксидазной активности молока, катализируют окисление органических и неорганических соединений перекисью водорода и другими
формами кислорода. Обнаруженная в молоке глутатион-пероксидаза
катализирует подобное окисление восстановленного глутатиона [25].
Лактопероксидаза. Нативная лактопероксидаза (ЛПО) синтезируется клетками молочной железы. Часть ее может освобождаться из лейкоцитов, содержится в молоке в больших количествах (30–100 мг/л) [44].
Молекула ЛПО построена из одной полипептидной цепи, содержащей 612 аминокислотных остатков. Ее молекулярная масса составляет 85 кДа. ЛПО содержит 15 цистеиновых остатков и углеводные
компоненты, составляющие 10 % общей массы молекулы белка [40].
В присутствии перекиси водорода, постоянно образующейся
в процессе метаболизма клеток, данный фермент обусловливает действие лактопероксидазо-антибактериальной системы молока [24].
К естественным источникам Н2О2 в организме относятся реакции,
25
катализируемые аминоксидазой, глюкозооксидазой, ксантиноксидазой
и супероксид-дисмутазой [25].
Для ЛПО свойственен антимикробный эффект, который связан с
активированием ЛПО окисления бромид-, иодид- и тиоционат-ионов
перекисью водорода [44]:
H2O2 + SCN− ---- (ЛПО) → H2O + ОSCN−.
H2O2 + J− ---- (ЛПО) → H2O + ОJ−.
Гипотиоцианат (ОSCN−) и гипоиодид-ионы (ОJ−) реагируют с некоторыми радикалами, которые образуются в процессе бактериального
метаболизма, в результате чего мембрана бактериальной клетки повреждается. Лактопероксидазная система ингибирует рост грамположительных бактерий и уничтожает грамотрицательные бактерии. В то же
время гипотиоцианат-ион не причиняет вреда клеткам организма человека, так как все млекопитающие имеют эффективные ферментные системы, которые быстро этот ион инактивируют [11].
Лактопероксидаза может окислять и некоторые неорганические
соединения, например иодид калия:
2KJ+H2O2 →2KOH+J2.
Данную реакцию используют в молочной промышленности для
контроля эффективности высокотемпературной пастеризации молока [48].
Однако проявление активности лактопероксидазы может быть
причиной появления в молоке и молочных продуктах различных пороков вкуса и запаха [44].
Внеклеточная Se-содержащая глутатионпероксидаза. Для инак-
тивации перекиси водорода в клетках высших животных существует
еще один важный фермент – Se-содержащая глутатионпероксидаза [10]
(ГПО), молекула фермента содержит 4 атома селена, отличается гидрофильными свойствами, что затрудняет ее проникновение в липидный
слой мембран; основная часть фермента (~70 %) локализована в цитозоле, и около 20–30 % – в митохондриях всех клеток млекопитающих.
ГПО имеет селеновые изоферменты. К ним относится внеклеточная
ГПО, обнаруженная в плазме и молоке [13].
26
Внеклеточная Se-содержащая ГПО обладает молекулярной массой около 22,5 кДа и по антигенным свойствам отличается от цитозольного изофермента. Недавно было показано, что эффективным донором
электронов для внеклеточной ГПО являются редуктаза тиоредоксина и
тиоредоксин, в присутствии нано- и миллимолярных концентраций которых и НАДФН фермент эффективно восстанавливал трет-бутилгидроперекись [100].
Внеклеточная глутатионпероксидаза играет важную роль в создании антиоксидантного барьера легких: более половины активности глутатионпероксидазы бронхоальвеолярной жидкости приходится на внеклеточный изофермент, а также контролирует содержание органических
перекисей и поддерживает так называемый «перекисный тонус» [101].
ГПО катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения – оксикислоты [13]:
2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O.
Все ГПО, подобно каталазе, способны также утилизировать пероксид водорода:
2GSH + Н2О2 → GSSG + ROH + 2H2O.
Кроме того, недавно получены данные, указывающие на возможность участия селен-содержащих ГПО в обезвреживании пероксинитрита [102]:
2GSH + ONOO- → GSSG + NO + H2O.
Фермент глутатионредуктаза далее восстанавливает окисленный
глутатион и завершает цикл [50]:
GS-SG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+.
Церулоплазмин (ЦП, феррооксидаза: О2-оксидоредуктаза). Це-
рулоплазмин – медьсодержащий гликопротеид, относящийся к α2-глобулиновой фракции плазмы крови млекопитающих, с молекулярной
27
массой около 15 кДа. В состав молекулы ЦП входит, по различным данным, 6–7 ионов меди [103–105].
Благодаря наличию шести прочно связанных ионов меди, церулоплазмин обладает широким спектром ферментативных активностей и действует как универсальный антиоксидант [106].
Обнаружено, что ЦП восстанавливает супероксидные радикалы
до кислорода и воды, т. е. обладает СОД-подобной активностью [107]:
•-
2О
+ 4H+ → O2 + 2H2O,
2
тогда как реакция истинного дисмутирования, катализируемая супероксиддисмутазой, протекает по схеме [10]:
−
3O
+ 4H+ → O2 + 2H2O2.
2
Но в отличие от супероксиддисмутазы (СОД), защищающей внутриклеточные структуры, ЦП функционирует в крови и перехватывает
свободнорадикальные формы кислорода, предохраняя таким образом от
их повреждающего действия липидсодержащие биоструктуры [96].
Однако были получены данные, что ЦП не оказывает влияния на
кинетику гибели супероксидных радикалов, но он взаимодействует
с их предшественниками – гидратированными электронами [70]. Позже
установили, что ЦП взаимодействует с восстановленной формой ксантиноксидазы, а не с супероксидными радикалами [71]. Это указывает
на то, что ЦП обладает слабой СОД-активностью и не является «ловушкой» супероксидрадикалов [108, 109].
С недавнего времени ЦП используется как медицинский препарат, в качестве основного антиоксиданта крови, стимулятора гемопоэза
[110], уменьшающего интоксикацию и иммунодепрессию [111–113],
что объясняется следующим. Поддержание окислительных реакций в
липидах биологических мембран на постоянном уровне является необходимым аспектом нормального функционирования клеток и тканей.
Показано, что при большинстве патологических состояний, особенно
при онкологических заболеваниях и атеросклерозе, существенно возрастает уровень ПОЛ, зависящий от двух факторов:
1. Любой патологический процесс ведет к мобилизации меди и
ее усиленному потреблению в очаге заболевания.
2. Уровень поступления меди с пищей обычно недостаточен.
28
Поскольку медь в организме не депонируется, единственным ее
источником являются собственные ткани. Поэтому при многих хронических патологиях происходит снижение уровня меди в тканях. Вследствие этого нарушается синтез медьзависимой супероксиддисмутазы и
происходит усиление процессов ПОЛ в тканях. Следовательно, при использовании церулоплазмина удается восстановить уровень меди и
снизить интенсивность процесса ПОЛ. При клинических испытаниях
препарата ЦП было показано, что он предотвращает развитие этого
осложнения [71, 72].
Антиоксидантная активность ЦП, по-видимому, объясняет и его
радиозащитный эффект. Введение экзогенного церулоплазмина при
действии ионизирующего излучения, приводящего к образованию
АФК, оказывает антиокислительное воздействие, что благотворно сказывается на состоянии организма [107].
Таким образом, среди многообразных функций ЦП в настоящее
время могут быть выделены следующие основные [116, 117]:
– транспорт и регулирование оборота меди в крови и органах;
– феррооксидазное действие и иммобилизация сывороточного
железа;
– антиоксидантное действие и др. [107].
Лизоцим (мурамидаза). Лизоцим выделен из молока в чистом
виде, изучены его физико-химические, иммунохимические свойства,
аминокислотный состав. Он является основным белком с молекулярной массой 18 000 и оптимумом действия при рН 7,9, термостабилен
в кислой среде [44]. Лизоцим обусловливает бактерицидные свойства
молока, катализируя гидролиз 1,4-β-связей между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина в полисахаридах клеточных стенок некоторых видов бактерий. Коровье молоко содержит небольшое количество лизоцима – в среднем 13 мкг в 100 мл [10].
Наряду с вышеперечисленными ферментами-антиоксидантами
в молоке содержатся ферменты-прооксиданты, снижающие активность
таких ингибиторов окисления молока, как аскорбиновая кислота, соединения с сульфгидрильными группами, каротиноиды и мочевина [25]. К ним относятся аминооксидаза, которая катализирует дезаминирование аминов, глюкозооксидаза – окисление β-D-глюкозы,
ксантиноксидаза – окисление большого числа химических соединений,
в частности альдегидов, цитохромоксидазы – окисление цитохромов
перекисью водорода и другими активными формами кислорода [24], аскорбатоксидаза – окисление аскорбиновой кислоты; сульфгидрокси-
29
даза, действуя как аэробная оксидаза, – окисление сульфгидрильных
групп в L-, D-цистеине, а также денатурированных сывороточных белках: липоксигеназа – окисление ненасыщенных жирных кислот и в особенности полиненасыщенных с образованием гидроперекиси, которая,
в свою очередь, может окислять не только ненасыщенные жирные кислоты, но и каротиноиды и аскорбиновую кислоту [25].
РНКазы. Рибонуклеаза была получена в качестве сопутствующего
продукта при выделении пероксидазы и некоторых минорных белков.
При этом были получены две формы фермента: А и В (из 1 л молока выделено соответственно 1,56 и 0,40 мг). По аминокислотному составу,
специфичности и целому ряду характеристик молочная рибонуклеаза А
аналогична панкреатической рибонуклеазе А, молекула которой состоит
из 124 аминокислотных остатков, образующих одну длинную полипептидную цепь. Рибонуклеаза А – это низкомолекулярный белок (молекулярная масса 13 700 Да). Она является основной формой фермента, составляя 90 % общей рибонуклеазной активности молока. Рибонуклеаза
В по аминокислотному составу и специфичности идентична рибонуклеазе А, а также панкреатической рибонуклеазе А и В. Она представляет
собой гликопротеид, содержащий 4,2 % гексозамина и 5,2 % маннозы.
Молочная рибонуклеаза В отличается от панкреатической рибонуклеазы
В, содержащей около 2,2 % глюкозамина и 5,7 % маннозы [118].
Возможный источник фермента – лизосомы секреторных клеток
молочной железы. Рибонуклеаза может попадать в молоко из плазмы
крови и других тканей организма. Содержание этого фермента в молоке
составляет в среднем 2,5 мг%, причем его содержание в сывороточных
белках больше чем в оболочках шариков жира.
В молоке коз рибонуклеазы содержится от 2 до 10 раз меньше,
чем в коровьем молоке, что, возможно, является одной из причин, повышающих стабильность жировой фазы молока [119].
Активность фермента связана с ключевыми аминокислотами (гистидин, лизин, цистин), способными образовывать дисульфидные мостики, и значительно зависит от рН молока. В молекуле рибонуклеазы
имеется четыре таких дисульфидных мостика, связывающих различные участки пептидной цепочки. Благодаря таким связям в рибонуклеазе складывается активный элемент, обусловливающий антиоксидантную активность РНКаз [120].
Ангиогенин. Особого внимания заслуживает присутствующий в
молоке ангиогенин (от греческого angion – сосуд), способный индуцировать ангиогенез – рост кровеносных сосудов. Молекула ангиогенина
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]