Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
по своей структуре и функциям уникальна. Это рибонуклеаза, по аминокислотной последовательности на 33 % гомологичная последовательности бычьей панкреатической РНКазы А. Каталистические характеристики АНГ и РНКазы близки. Посредством механизма перефосфорилирования/гидролиза они расшепляют связь в РНК преимущественно у 3'-конца пиримидиновых оснований [119, 120].
Ангиогенин представляет собой одноцепочечный белок и из-за
сравнительно высокой структурной стабильности обладает значительно высокой устойчивостью к высоким температурам и экстремальным значениям рН.
В коровьем молоке он представлен тремя молекулярными формами: ангиогенином-1 (молекулярная масса-14кДа), ангиогенином-2
(~20 кДа) и лактогенином (~17 кДа) [10].
Ангиогенин – основной белок (его изоэлектрическая точка более
9,5), вместе с другими катионными белками (лактоферрином, лактопероксидазой рибонуклеазами А и Б, лизоцимом) входит в защитный комплекс катионных белков молока [121], оказывая бактериостатический
эффект. Считают, что ангиогенин является одним из неспецифических
факторов антибактериального комплекса молока [122]. Эффект проявляется уже при дозах, соответствующих концентрации ангиогенина в
молозиве, и повышается с увеличением дозы [123]. Ангиогенин также
оказывает корректирующее влияние на надмолекулярные белковые
структуры крови пациентов с тяжелыми заболеваниями [124], проявляет иммуномодулирующее действие на уровне цитокинового звена
иммунитета [121]. Получены данные, свидетельствующие о его корректирующем действии при нарушениях, вызываемых стрессом в организме животных [125]. В коровьем молоке его содержание составляет
от 2 до 10 мг/л, что намного больше, чем в крови животного [126], и
зависит от ряда факторов: породы животного, условий содержания, сезонности, состава кормов, стадии лактации [127].
По уровню содержания ангиогенина молочное сырье следует расположить в следующем порядке: обезжиренное молоко > сыворотка изпод твердых сыров > сыворотка из-под мягких сыров > сыворотка творожная > пахта [121].
Из-за сравнительно высокой структурной стабильности ангиогенин обладает значительно высокой устойчивостью к высоким температурам и экстремальным значениям рН, в связи с чем в той или иной
степени он сохраняется во вторичном молочном сырье. Как источник
ангиогенина молочное сырье имеет преимущества по сравнению с
генно-инженерным [126].
31
2 . 2 . В и т а м и н ы — к о м п о н е н т ы
а н т и о к с и д а н т н о й с и с т е м ы м о л о к а
Витамины представляют собой группу низкомолекулярных органических соединений относительно простого строения и разнообразной химической природы, занимающих особое место в питании человека. Они имеют важное значение как группа веществ, ответственных
за защиту организма от неблагоприятного воздействия окружающей
среды, благодаря ярко выраженным антиоксидантным свойствам [48].
2 . 2 . 1 . П р о в и т а м и н ы
Одними из наиболее исследованных антиоксидантов молока являются пигменты каротиноидного ряда, синтезируемые растениями и
микроорганизмами. Это С40-соединения, построенные из восьми
С5-изопреновых фрагментов [128].
Различают α- и β-каротин, лютеин, кантаксантин, астаксантин,
зеаксантин, кроцетин, фукоксантин и др.
Обнаруженные антиоксидантные свойства каротиноидов обусловлены особенностью их строения – наличием у них цепочки двойных сопряженных связей, в которой π-электроны делокализованы по
всей длине [129] (рис. 2.6).
Энергетические характеристики этой молекулярной структуры
определяют ее антиоксидантные свойства [130], что обусловлено их высокой неспецифичностью, реакционной способностью и тропностью к
соединениям с неспаренным электроном – свободным радикалам [128].
Каротиноиды могут нейтрализовать перекисные радикалы и обрывать цепные реакции свободнорадикального окисления ненасыщенных жирных кислот [131].
Чаще всего рассматриваются три направления взаимодействия
каротиноидов (Car) с пероксидными радикалами: присоединение свободного радикала по двойной связи каротиноида с образованием радикального продукта (1), отрыв атома водорода от аллильного фрагмента
каротиноида (2) и перенос электрона от каротиноида к пероксильному
радикалу с образованием катион-радикала каротиноида (3) [132]:
32
ROO· + Car → ·Car-OOR; (1)
ROO· + Car → Car· + ROOH; (2)
ROO· + Car → ROO- + Car+. (3)
Рис. 2.6. Структура некоторых наиболее активных
каротиноидов-антиоксидантов, обладающих биологической
активностью [10]
Следует отметить, что радикалы, в свою очередь, могут служить
источниками продолжения цепи перекисного окисления липидов [50].
К числу активных форм кислорода также относится его метастабильная
форма – синглетный кислород (1О2) с возбужденным электроном, имеющим более высокую орбиталь по сравнению с обычной. 1О2 генерируется в процессе фотохимических, ферментативных реакций и в процессе перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биомембранах, что может сопровождаться его повреждающим действием в отношении ДНК
33
и мутагенным эффектом. Найдено, что каротиноиды обладают способностью гасить 1О2, поглощая энергию возбужденного электрона без каких-либо химических превращений, чему сопутствует возвращение 1О2
в основное состояние без повреждения окружающих биологических систем:
1
О
+ -каротин → О2 + 3(-каротин).
2
По мере увеличения числа двойных сопряженных связей в молекуле каротиноида повышается эффективность дезактивации 'О2; при
этом уменьшаются уровни всех ее возбужденных энергетических состояний. Следовательно, при увеличении длины полиеновой цепочки
возрастает степень ее стабилизации и уменьшается энергия относительно более низкого триплетного π-электронного состояния. Это обстоятельство приводит к повышению вероятности переноса неспаренного электрона на молекулу каротиноида, а значит и к увеличению антиоксидантной активности последнего.
Наряду с гашением синглетного кислорода каротиноиды способны нейтрализовать перекисные радикалы и обрывать цепные реакции свободнорадикального окисления ненасыщенных жирных кислот
путем передачи возбужденного неспаренного электрона с пероксирадикала на молекулу каротиноида [130].
Помимо длины полиеновой цепочки каротиноидов на уровень
АОА оказывают влияние их концевые группы (рис. 2.7).
Кроме структурных особенностей, эффективность антиоксидантного действия зависит от факторов окружения в месте нахождения молекулы каротиноида в биомембране. К этим факторам относятся: парциальное давление кислорода рО2, место и интенсивность инициации
свободных радикалов и кооперативное взаимодействие с другими антиоксидантами. Кроме того, каротиноиды не проявляют значительной
АОА в случае индукции радикалов в водной фазе и, наоборот, увеличивают свой антирадикальный потенциал при совместном действии
с другими жирорастворимыми антиоксидантами – -токоферолом и ко-
энзимом Q10.
Свободнорадикальная модификация макромолекул и биологических структурных компонентов мембран – общее звено для подавляющего большинства биохимических процессов, в которых принимают
участие каротиноиды. Регуляторные эффекты каротиноидов в значительной степени обусловлены их способностью встраиваться в мембранные фосфолипидно-белковые структуры. Ориентация молекулы
34
каротиноида в мембране может быть существенным фактором проявления ее антиоксидантной активности вследствие изменения характера
ее контакта с алкильными цепями липидов, а изменение текучести мембраны может влиять на конформацию, а значит и активность мембранных белков и рецепторов [128].
Наиболее известным и широко распространенным каротиноидом
является β-каротин – предшественник витамина А. β-каротин является
наиболее эффективным тушителем синглетного кислорода, как указывалось выше, а также может участвовать в регенерации токоферильного радикала с образованием катион-радикала β-каротина, как это следует из реакции [13]:
-ТфО + Н+ + β-каротин → -ТфОН + β-каротин+.
Поскольку β-каротин является полиненасыщенным соединением, он сам может легко окисляться по радикальному механизму и выступать в качестве прооксиданта – индуктора свободнорадикальных реакций, особенно при увеличении его концентрации или рО2 в клетке.
Большинство продуктов животного происхождения содержат незначительное количество -каротина. Молоко и сливочное масло содержат -каротин только в тех случаях, когда животные едят корма, богатые ими [133].
2 . 2 . 2 . Ж и р о р а с тв о р и м ы е в и т а м и н ы
Витамин А (ретинол). Витамин А широко распространен в при-
роде. В растительных тканях он встречается главным образом в виде
провитамина – каротиноидов, большая часть которых превращается в
организме в витамин А. К ним относятся α- и -каротины, ликопин, лю-
теин и др. [134].
Превращение каротиноидов в ретинол путем окислительного
расщепления углеродной цепи -каротина осуществляется по двум
направлениям: по центральной двойной цепи либо по периферическим
двойным цепям (рис. 2.7) [11].
35
Рис. 2.7. Схема превращения -каротина и витамина А
Витамин А (антиксерофтальмический) [135] (С20Н30О) представляет собой циклический ненасыщенный одноатомный спирт с пятью
двойными связями в молекуле и одним -ионовым кольцом. Боковая
цепь состоит из 9 атомов углерода с 4 сопряженными двойными связями. Наиболее распространенными природными формами витамина
А, которые содержатся только в тканях животных организмов, являются ретинол (витамин А1) и ретинолпальмиат. К природным формам
витамина А относятся также ретиналь (ретинальдегид) и ретиноевая
кислота, которые образуются в результате окисления спиртовой
группы ретинола [11].
В ряде работ [136, 137] показано, что витамин А является достаточно активным акцептором свободных радикалов, эффективность которого сравнима с типичными антиоксидантами, например ионолом
[11]. Его антиоксидантное действие связывают с нормализацией структурно-функциональных свойств мембран и участием в обмене тиоловых соединений. На основании серии опытов с цистеином и радиоактивным метионином показано, что витамин А тормозит превращение
сульфгидрильных групп в дисульфидные.
О том, что витамин А может проявлять антиоксидантные свойства, свидетельствуют также данные о снижении ретинолом активности НАДФ·Н и аскорбатзависимого перекисного окисления в микросомах печени.
Однако противоокислительное действие ретинола в присутствии
кислорода относительно невелико, потому что он сам подвержен аутокаталитическому окислению с образованием свободных радикалов [10].
36
Что касается молока, концентрация витамина А в нем колеблется
от 0,04 до 1 мг/кг. Она повышена в молозиве и в молоке первого месяца
лактации и к концу лактации понижается. Наиболее богато витамином
А и каротиноидами молоко летом, когда животные поедают зеленый
корм, содержащий много каротинов [44].
Витамин Е. Витамин Е, или токоферол, включает группу жирорастворимых, химически сходных соединений, производных токоферола, обладающих разной степенью биологической активности в предупреждении возникновения недостаточности витамина Е у млекопитающих. В основе их химического строения лежит углеродный скелет,
известный в химии под названием токола, который включает двухциклическое ядро хромана (бензодегидропирана) и углеводородную (изопреновую) боковую цепь, состоящую из 16 атомов углерода. Очень специфично для молекулы токоферолов наличие одной гидроксильной и
одной-трех метильных групп, связанных с углеродными атомами ядра
хромана. В природе встречаются четыре производных токола с насыщенной боковой цепью фитола и четыре – с ненасыщенной боковой цепью с тремя двойными связями, которые называются токотриенолами.
В зависимости от количества и расположения метильных групп в бензольном кольце они обозначаются как α-, β-, γ- и δ-токолы и токотриенолы (рис. 2.8) [138].
α- токоферол β- токоферол
1. 3.
2. 4.
Рис. 2.8. Структурные формулы токолов и токотриенолов:
1 – α-токоферол; 2 – β-токоферол; 3 – γ-токоферол; 4 – δ-токоферол
α- Токоферол (5,7,8-триметилтокол) является наиболее биологически активным [11]. Его активность принята за 100 %. Активность его
изомеров (β- и γ-токоферолов) равна соответственно 50 и 80 % его
37
активности [10]. Витамин Е относится к основным антиоксидантам защитной системы молока, предотвращая окисление липидов, витамина
А и β-каротина [139].
Сравнительная антиоксидантная активность в стабилизации витамина А, α-, β- и γ-токоферола (в %) равна соответсвенно 100, 130 и
180. Стабилизатором витамина Е является аскорбиновая кислота [10].
К настоящему времени накопилось большое число доказательств
стабилизирующего действия витамина Е на мембранные структуры, в
которых выражены процессы ПОЛ. Но только восстановленные (фенольные) формы, имеющие свободную гидроксильную группу, рассматриваются как ингибиторы свободнорадикальных процессов. Их окисление начинается с отрыва от молекулы водорода с образованием феноксильного радикала, что было доказано методом ЭПР (рис. 2.9) [13]. Последний малоактивен и способствует прерыванию цепи окисления [50].
Рис. 2.9. Механизм окисления токоферола
При его окислении возможно образование различных редуцирующих структур его радикалов (рис. 2.10) [10].
Наиболее известна реакция витамина Е с пероксильным радикалом, приводящая к образованию гидроперекисей [140, 141]:
Тф-ОН + ROO· → Тф-О· + ROOH.
38
Рис. 2.10. Токоферол и резонансные структуры его радикалов
Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции (Тф-О·), стабилен и не способен участвовать в развитии цепи.
Наоборот, радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей, восстанавливая их, а сам превращается
в стабильную окисленную форму – токоферолхинон [140]:
Тф-О· + ROO· → ROO -Тф-О,
ROO -Тф-О + Н2О → токоферолхинон + ROOH.
С другой стороны, токофероксильные радикалы (-Тф-О), образующиеся при взаимодействии -токоферола (-Тф-ОН) с перекисными радикалами, при взаимодействии с жирными кислотами могут
вновь инициировать образование радикалов [13]:
ROO + -Тф-ОН → ROOH + -Тф-О
-Тф-О + RH → -Тф-ОН + R
Двойственность анти- и прооксидантного действия токоферола
позволяет рассматривать его не только как антиоксидант, но и как соединение, поддерживающее процессы ПОЛ в организме на определенном стационарном уровне.
39
В природе встречаются лишь свободные формы токоферола, которые быстро разрушаются. В организме человека и животных витамин Е не синтезируется, его образуют растения. Источником витамина
Е для человека и животных являются пища и корма. В молоке, согласно
[128], содержится от 0,2 до 1,9 мг/кг витамина Е, причем его количество
летом выше, чем зимой [44].
2 . 2 . 3 . В о д о ра с тв о ри м ые в ит а м и н ы
Витамин С (L-аскорбиновая кислота, АК) [50]. Аскорбиновая
кислота играет в организме человека фундаментальную биохимическую и физиологическую роли. Она необходима для нормального развития соединительной ткани, процессов регенерации и заживления,
устойчивости к различным видам стресса, обеспечения нормального
иммунологического статуса организма, защиты от вирусных инфекций,
стимуляции макрофагов, индукции эндогенного интерферона и поддержания процессов кроветворения. Витами С активно участвует в окислительно-восстановительных процессах, оказывает влияние на белковый, углеводный и холестериновый обмен, образование стероидных
гормонов, нейромедиаторов и карнитина, всасывание железа [142–146].
Витамин С активирует ферменты синтеза основных белков соединительной ткани, образующей основу костной и хрящевой тканей, кожи и
сосудистой стенки (коллагена и эластина кровеносных сосудов) [146,
147]. Он известен своими защитными свойствами от вредного воздействия неблагоприятной экологической обстановки. Витамин С влияет
на активность ферментных систем метаболизма и обезвреживание и
выведение из организма экзо- и эндоксенобиотиков, включая продукты
метаболизма, лекарства и яды [146]. Доказана его способность выводить избыток свинца, нитрозаминов, мышьяка, бензолов, цианидов
в составе комплексной терапии [144, 145, 148]. Исключительно широкий спектр действия витамина С обусловливает множество показаний
к его применению здоровыми и больными людьми [11].
Аскорбиновая кислота может выступать в качестве донора и акцептора атомов водорода благодаря наличию в структуре молекулы
двух енольных групп (рис. 2.11) [13].
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]