Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции.
.pdf
молока и продуктов на его основе для профилактики и лечения широ-
Белки, г
28
Метионин, цистин, мг
1100
Фосфатиды, мг
500
Е
0,9
А
0,2
β-Каротин
0.2
Ниацин (РР)
1,0
Пиридоксин (
0,4
Холин
200
Инозит
180
С
10 Р 0
Липоевая кислота, мкг
0,8
Сера, мг
280
Железо, мг
1
Медь
120
Селен, мкг
20
кого ряда патологий (табл. 2.2) [11].
Таблица 2.2
Биоантиоксиданты молока и молочной продукции
в пересчете на молоко
Г л а в а 3 . М Е Т О Д Ы О П Р Е Д Е Л Е Н И Я
А Н Т И О К С И Д А Н Т Н О Й А К Т И В Н О С Т И :
С Р А В Н И Т Е Л Ь Н Ы Й А Н А Л И З
Возросший в последнее время интерес к антиоксидантам обусловлен их важной ролью в регуляции протекания свободнорадикальных
превращений и окислительных процессов [180], что связано со способностью свободных радикалов блокировать вредное воздействие на организм, защищая человека от последствий окислительного стресса, вызванного различного вида облучением, загрязненностью среды, недоброкачественной пищей и даже некоторыми лекарственными препаратами,
лечебными процедурами, дурными привычками и т. д. [9].
Сегодня длительный окислительный стресс однозначно относят
к первопричинам развития тяжелейших патологий (онкологических,
сердечно-сосудистых, диабету и т. д., а также его считают одной из причин преждевременного старения).
Одно из перспективных решений проблемы – применение экзогенных антиоксидантов (природных), способствующих поддержанию
антиоксидантного статуса человека, в связи с чем первоочередной задачей становится определение АО в пищевых продуктах, которые способны стать исключительным лечебно-профилактическим звеном в системе защиты человека, если они богаты антиоксидантами.
Поэтому для выбора качественной, полноценной продукции
с высокими антиоксидантными свойствами необходим метод достоверной оценки ее антиоксидантной активности [180]. Но, как было отмечено, антиоксиданты отличаются друг от друга различным принципом
действия [9], в связи с чем методы исследования антиоксидантной активности различаются по типу источника окисления, окисляемого соединения и способу его измерения, а также по уровню интегральности:
определяются либо отдельные антиоксидантные компоненты, либо общая (суммарная, интегральная) антиоксидантная активность, определяемая в большинстве методов, что вполне объяснимо. Это связано с многообразием и полифункциональным характером АО пищевых продуктов, роль которых может разительно отличаться в разных условиях активации свободно-радикальных процессов, и невозможностью их индивидуального определения из-за недостаточного развития инструментально-аналитической базы. Кроме того, информация о концентрации
62
отдельных АО в природном сырье является более чем недостаточной,
так как она не будет учитывать процессы взаимного окисления / восстановления антиокислителей, а также влияния на них природы и
свойств биосистемы.
В настоящее время разработано большое число методов и методик определения АО и АОА пищевых продуктов, основанных на различных принципах и использующих разные реагенты, модельные системы и приборы. Эти методы дают широкий набор результатов, часто
несопоставимых друг с другом, которые [180] нежелательно использовать отдельно, и полученная информация требует осторожной интерпретации. Это породило также многообразие терминов, определяющих
антиоксидантные свойства соединений или их комплексов: антиоксидантная активность, антиоксидантная емкость, антиоксидантная сила,
антиоксидантные способности и др. [181–218], которых объединяет то,
что все они связаны с концентрацией АО.
Все известные методы аналитического контроля АО можно разделить на прямые и косвенные. В основе последних – измерение влияния антиоксидантов на ингибирование степени или скорости потребления модельных реактивов, или образования продуктов окисления,
т. е. при определении антиоксидантной активности обычно используется протекающая по радикальному механизму модельная реакция
(чаще всего окисления) какого-либо индивидуального соединения, по
влиянию на протекание которой и оценивается антиоксидантная активность индивидуального соединения или смеси. Кинетика контролируется либо по поглощению кислорода способами измерения объема,
либо по изменению характеристик реакционной смеси – изменению поглощения электромагнитного излучения, флуоресценции, люминесценции и т. д. В ряде случаев создаются условия для генерирования свободных радикалов с постоянной скоростью добавлением инициаторов
либо с химической генерацией радикалов в результате протекания контролируемого химического процесса [180]. В этом случае АОА пищевых продуктов можно выразить количеством вещества-стандарта, производящего эквивалентный антиоксидантный эффект (например, мг аскорбиновой кислоты на 1 г продукта) [219].
Что касается прямого определения антиоксидантов, это относится только к методу электронного парамагнитного резонанса (ЭПР),
позволяющему проводить прямое обнаружение свободнорадикальных
реакций и непосредственное изучение изменения концентрации свободных радикалов в биосистеме [217].
63
ЭПР-спектроскопия является наиболее прямым физическим методом изучения свободных радикалов и представляет собой разновидность
магнитной радиоспектроскопии. Сущность метода заключается в том,
что молекулы или частицы с неспаренными электронами, образующиеся
на первом этапе взаимодействия окисляемой молекулы с кислородом, а
также в ходе цепных окислительных реакций при распаде перекисных
соединений, обладают парамагнитными свойствами. Регистрация их
осуществляется путем определения интенсивности сигнала характерного спектра электронного парамагнитного резонанса [220].
Однако попытки непосредственно обнаружить методом ЭПР радикалы кислорода или липидов в биологических системах [221] in vivo
оказались неудачными, поскольку стандартные концентрации большинства радикалов, таких как радикалы кислорода или липидов, в биологических системах слишком малы [222]. Положительные результаты
были получены при использовании метода спиновых ловушек. Спиновые ловушки – это молекулы, которые при взаимодействии с нестабильными радикалами образуют стабильные нитроксильные радикалы,
так называемые спиновые аддукты, сигналы ЭПР которых затем измеряются с целью качественного и количественного анализа соответствующих радикалов [222–225].
С учетом методов косвенной регистрации действия свободных
радикалов и возможности определения ферментов, которые нейтрализуют активность АФК, можно выделить 3 большие группы непрямых
методов определения АО, основанных на фотометрическом, хемилюминесцентном и электрохимическом детектировании результата, которые обобщают ряд методик, использующих различные реактивы или
индикаторные системы (рис. 3.1).
3 . 1 . Л ю м и н е с ц е н т н ы й а н а л и з
Люминесценция – свечение вещества после поглощения им энергии возбуждения:
→ М + hv.
Переходя в более низкое энергетическое состояние, возбужденные частицы испускают квант света – люминесцируют. От излучения
64
нагретых тел люминесценция отличается неравновесностью, так как
практически не включает тепловую энергию. Это избыточное над тепловым излучение часто называют холодным светом. Некоторые вещества обладают способностью светиться «холодным светом», который
называется люминесцентным. Люминесцентное свечение может быть
вызвано действием различных видов энергии. Свечение вещества под
влиянием энергии химических реакций называется хемилюминесценцией [226].
Рис. 3.1. Классификация методов определения АОА
65
Хемилюминесценция – процесс, в известном смысле, обратный
фотохимической реакции. Первая стадия любого фотобиологического
процесса состоит из поглощения света, образования возбужденной молекулы, поглотившей фотон, и первичной фотохимической реакции.
Конечная стадия хемилюминесценции состоит из химической реакции,
образования возбужденной молекулы продукта реакции и высвечивания фотона хемилюминесценции [227–229].
Многие исследователи считают, что измерение интенсивности
хемилюминесценции – это наиболее информативный метод для изучения действия антиоксидантов [227]. Все хемилюминесцентные методы
определения уровня АО основаны на сравнении хемилюминесценции
радикал-генерирующей системы в отсутствие и в присутствии антиоксидантов. При добавлении последних в радикал-генерирующую систему происходит изменение кинетики свечения, вызванное изменением количества свободных радикалов [227].
По отношению к АФК ранее было показано, что реакции рекомбинации радикалов супероксида, гидроксила и липидных радикалов сопровождаются очень слабым свечением, которое первоначально было
названо сверхслабым свечением [230] (ultra-weak luminescence) или неактивированной (non-enhanced) хемилюминесценцией [231]. Но и
в этом случае низкая интенсивность сигнала стала одним из существенных препятствий в применении данного метода [232–235]. В связи
с этим получили широкое применение так называемые активаторы хемилюминесценции [236] (Enhancers – усилители). Наиболее известны
химические активаторы, вступающие с определенными радикалами
в реакции, которые сопровождаются свечением: это люцигенин, дающий свечение с радикалами супероксида, и люминол, дающий мощное
свечение в присутствии радикалов гидроксила [227].
Так, наибольшее распространение получили методики, основанные на хемилюминесцентной реакции между люминолом и 2,2’-азобис(2-амидинпропаном (АБАП), распадающимся при нагревании на
два свободных радикала. При этом интенсивность хемилюминесценции является мерой количества радикалов. При введении в систему антиоксидантов количество радикалов уменьшается, и падает интенсивность хемилюминесценции. Существует несколько вариантов этой методики, позволяющих различными способами определить количество
антиоксидантов [237].
Не менее популярны в последнее время способы исследования по
определению антиоксидантной активности различных веществ методом
66
индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием биохемилюминометра БХЛ-07 [238]. Сущность метода: каталитическое разложение перекиси водорода ионами двухвалентного железа, которое сопровождается сверхмалым свечением вследствие рекомбинации неустойчивого радикала , который образуется наряду
с другими свободными радикалами ( ) по реакции
Фентона:
ROOH+→+ .
Свет от измеряемой пробы попадает на детектор – фотоэлектронный умножитель, преобразуется в электрический сигнал, который после усиления и предварительной обработки подается на внешнюю ЭВМ
(ПК) для индикации и расчета [239, 240].
Для усиления сверхслабого свечения наряду с вышеперечисленными активаторами авторы работы [221] предложили ряд физических
активаторов хемилюминесценции, таких как краситель родамин Ж
[241, 241], комплекс европия с тетрациклином [243–245] и некоторые
лазерные красители, производные кумарина [246, 247]. Физические активаторы (Sensitizers – сенсибилизаторы) не вступают в реакцию с радикалами, но увеличивают квантовый выход хемилюминесценции за
счет переноса энергии электронного возбуждения от молекул – продуктов реакции на активатор [248].
В табл. 3.1 приведены некоторые активаторы хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов [221].
Чувствительность метода хемилюминесценции примерно в
100 раз превышает чувствительность метода ЭПР [249].
Также заслуживают внимания методы TRAP и TAR, что означает: TRAP (total reactive antioxidant potential) – общая потенциальная
активность АО и TAR (total antioxidant reactivity) – общая АОА. Считают, что TRAP отражает количество антиоксиданта в системе, а TAR –
его активность, т. е. скорость взаимодействия АО с радикалами [237].
TRAP основан на измерении латентного периода (периода времени, в течение которого не наблюдается свечения хемилюминесценции), возникающего в результате добавления антиоксиданта, а в основе
TAR лежит измерение снижения интенсивности хемилюминесценции
(ХЛ) при добавлении исследуемого антиоксиданта в систему. Конечные численные значения величин выражаются в эквивалентах [250] известных антиоксидантов как-то: люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-
67
1,4-фталазинион, гидразид 3-аминофталевой кислоты), АБАП (2,2´-азо-
Активатор
Коэффициент усиления
(число раз)
Люминол
70
Европий-тетрациклин
1120
Родамин
37
Кумарин С-525
1650
Нильский синий
7
бис(2-амидинопропан)гидрохлорид), кверцетин (3,3ʹ,4ʹ,5,7-пентагидроксифлавон), аскорбат натрия (натриевая соль g-лактон 2,3-дегидроL-гулоновой кислоты) [237], дигидрокверцетин (ДГК) (3,5,7,3ʹ,4ʹ-пентаоксифлавон), тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхромо-2-карбоновая кислота) [251]. Последний являлся водорастворимым аналогом
токоферола (витамина Е), в настоящее время принят за стандарт для
оценки антиоксидантной активности и его активность условно принимается за единицу, а антиоксидантная активность исследуемого вещества выражается в эквивалентных молях тролокса на массу образца
(мкмоль/мг) [237].
Таблица 3.1
Активаторы хемилюминесценции, сопровождающей
цепное окисление липидов
Достоинства ХЛ методов – высокая чувствительность, возможность получения воспроизводимых результатов за короткое время, отсутствие длительной пробоподготовки, но основное достоинство заключается в том, что метод является единственным, позволяющим
наблюдать за концентрацией радикалов, ведущих цепи окисления липидов. Используется для оценки АОА пищевых продуктов, в том числе
для определения антиоксидантной активности молока и кисломолочных продуктов [252].
Недостатки: невозможно определить супероксид-ион (
), син-
глентный кислород (), перекись водорода () и пероксинитрит
(OON) [180].
Флуоресценция. Из всех типов люминисценции для аналитиче-
ских целей главным образом используется флуоресценция, свечение,
затухающее сразу после прекращения возбуждения [226]. Метод основан на явлении спонтанного непрерывного сверхслабого свечения
68
тканей и биосред в видимой области спектра в результате СРО или при
протекании реакций с участием перекисей [259].
Метод флуоресценции для определения АОА основан на измерении интенсивности флуоресценции определенного соединения и ее изменении от времени протекания реакции. В присутствии соединений,
связывающих кислородные радикалы, увеличивается время флуоресценции вследствие защитного действия антиокислителей. Количественное определение АОА осуществляется по площади между двумя
кривыми – свободной реакции и с добавлением антиоксидантов. Степень уменьшения флуоресценции есть мера степени деградации флуоресцирующего соединения под воздействием кислородных радикалов.
Первоначально в качестве флуоресцирующего вещества применялся
белок ß-фикоэритрин [180 ,226], в последнее время используется более
стабильное флуоресцирующее соединение – флуоресцеин [180].
В присутствии ингибиторов свободнорадикальных реакций хемилюминесценция ослабляется, так как при этом снижается концентрация свободных радикалов [226].
Измерение спонтанного сверхслабого свечения осуществляется
люминометрами, в которых в качестве детектора слабых световых потоков служит фотоэлектронный умножитель [252].
Данный метод достаточно прост и чувствителен, может определять как водорастворимые, так жирорастворимые антиоксиданты. Однако он длителен по времени, так как анализ одного образца занимает
более 1 ч, требует наличия флуоресцентного детектора, а также измеряет только АОА против пероксидного и гидроксильного радикалов, не
затрагивая супероксид-ион (
), синглентный кислород (), пере-
кись водорода () и пероксинитрит (OON) [180].
Применение для оценки АОА молочной продукции. Как показал
анализ специальной литературы [246–255], метод ХЛ использовали для
оценки антиокислительной способности молочной продукции. Это молоко негомогенизированное, одна пастеризация (ж = 2 %); молоко гомогенизированное, две пастеризации (ж = 2,5 %); томленное молоко
перед заквашиванием (ж = 2,5%); ряженка (ж = 2,5 %), йогурт
(ж = 2,5 %); кефирный напиток бифидок (ж = 2,5 %); кефирный напиток бифидок сладкий (ж = 2,5 %); кефир (ж = 2,5 %) [253].
Для каждого из указанных продуктов были изучены интенсивность свободнорадикального окисления с помощью -индуцированной хемилюминесценции, полученные данные представлены в табл. 3.2.
69
Таблица 3.2
Объект
исследова-
ния
Светосумма,
усл. ед. мин
Спонтанная
светимость,
усл. ед.
Амплитуда
быстрой
вспышки,
усл. ед.
Амплитуда
медленной
вспышки,
усл. ед.
Молоко
одна пастеризация
(ж = 2 %)
7,10,22
0,770,08
1,08
1,04
Молоко
две пастеризации
(ж = 2,5 %)
9,37
1,03
1,47
1,37
Томленое
молоко
(ж = 2,5 %)
60,391,09
10,46
22,75
11,04
Ряженка
(ж = 2,5 %)
61,821,09
4,070,25
10,201,41
25,89
Йогурт
(ж = 2,5 %)
6,15
0,750,03
1,310,03
1,070,02
Бифидок
5,680,25
2,780,20
2,030,35
0,75
Бифидок
сладкий
5,990,25
5,21
8,62
0,81
Кефир
6,290,24
2,520,49
2,33
0,8
Параметры -хемилюминесценции в процессе производства
молочных продуктов, (Xm)
кисломолочных продуктах, особенно в йогурте, так как уровень свободнорадикального окисления в йогурте оказался наименьшем по сравнению с остальными образцами (все параметры хемилюминесценции
оказались меньше).
его и козьего молока с последующим сопоставлением с результатами
спектрофотометрического определения веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (табл. 3.3) [255].
Табличные данные указывают на повышенное содержание АО в
В работе [254] охарактеризованы показатели ХЛ анализа коровь-
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]