Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биотехнологии и асептики проведения процессов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Рис. 2.6. График конкурентного ингибирования в координатах
Михаэлиса–Ментен
Рис. 2.7. График конкурентного ингибирования в координатах
Лайнуивера–Берка
Неконкурентное ингибирование. В случае присоединения инги-
битора вне активного центра происходит неконкурентное ингибирование. Это взаимодействие приводит к изменению активного центра, что
делает невозможным присоединение субстрата к активному центру.
Поскольку при этом типе ингибирования связывание происходит не
в активном центре, избыток субстрата в реакционной среде не снимает
ингибирования. В то же время неконкурентный ингибитор не мешает
связыванию субстрата с активным центром. В результате формируется
тройной комплекс фермент–субстрат–ингибитор (E-S-I), в котором
фермент уже не способен изменить конформации и обеспечить проведение реакции. Поэтому общее количество реакционноспособных комплексов E-S при этом снижается.
Примером действия неконкурентного ингибитора может служить
действие цианидов. Известно, что синильная кислота (цианиды) связывается с гемовым железом ферментов дыхательной цепи, в результате
чего останавливаются дыхательные процессы на уровне клетки.
61
Другим примером неконкурентного ингибирования является связывание ионов тяжелых металлов (Cu2+, Hg2+, Ag+) с SH-группами белков.
При неконкурентном ингибировании максимальная скорость
ферментативной реакции (Vmax) снижается в (1 + I/Ki) раз. Константа
Михаэлиса (Km) не изменяется. Поэтому избыток субстрата не может
повлиять на состояние активного центра и работу фермента. На рис. 2.8
и 2.9 представлено влияние неконкурентного ингибитора на прохождение ферментативной реакции.
Рис. 2.8. График неконкурентного ингибирования в координатах
Михаэлиса–Ментен
Рис. 2.9. График неконкурентного ингибирования в координатах
Лайнуивера–Берка
Бесконкурентное ингибирование. Механизм этого типа ингиби-
рования более сложен, чем ранее описанные типы. В этом случае сначала происходит образование субстрат-ферментного комплекса, к которому затем присоединяется ингибитор. Избыток субстрата приводит
к увеличению концентрации субстрат-ферментного комплекса, при
этом наблюдается усиление связывания с ним ингибитора. Связывания
62
63
бесконкурентного ингибитора со свободным ферментом не происходит. Ингибитор может образовывать связи либо с молекулой субстрата,
либо с ферментом, изменившим свою конформацию в силу начала ферментативного катализа. Образовавшийся тройной комплекс E-S-I также
непродуктивен.
В качестве примера бесконкурентного ингибитора можно приве-
сти антибиотик пенициллин. Известно, что в состав клеточной стенки
бактерий входит пептидогликан муреин, представляющий собой соединение, состоящее из полимерных цепей на основе глюкозы, «сшитых»
между собой двухосновными аминокислотами. Связывание между собой цепей пептидогликана происходит при непосредственном участии
фермента транспептидазы. Пенициллин может встраиваться в активный центр фермента, и его лактамное кольцо мимикрирует под переходное состояние фермента. Подобный тип взаимодействия характерен
для конкурентного ингибирования. Однако в силу того обстоятельства,
что происходит одновременное падение Vmax и Km, этот случай следует рассматривать как бесконкурентный.
Максимальная скорость реакции Vmax и константа Михаэлиса
Km при бесконкурентном ингибировании снижаются в одинаковое
число раз. Введение в реакционную среду избытка субстрата не оказывает влияния на доступность активного центра. Поэтому в двойных обратных координатах для разных концентраций субстрата получаем семейство параллельных прямых.
Смешанное ингибирование. Механизм смешанного ингибирова-
ния связан с неограниченной возможностью ингибитора присоединяться в любой части ферментной единицы. Это может происходить
как в активном центре фермента, так и вне его. Характерной особенностью такого типа ингибирования является то обстоятельство, что даже
после присоединения ингибитора сохраняется частичная активность
фермента. В качестве примера можно привести остановку роста микромицетов в присутствии ртутьорганического вещества мертиолата. Механизм бактерицидного действия мертиолата заключается в том, что он
выступает ингибитором ключевого фермента утилизации сахарозы сахаразой, в результате чего нарушаются первичные реакции метаболизации субстрата.
Для этого типа ингибирования оба характеристических пара-
метра (Km и Vmax) будут изменяться при добавлении ингибитора. Однако в отличие от предыдущего случая они будут изменяться в неодинаковой степени. Поэтому на графике, построенном в системе
64
обратных координат, они не будут расположены параллельно, а точка
пересечения прямых определяется соотношением констант ингибирования. Если связывание с ферментом более прочное, то Km увеличивается, и тогда прямые будут пересекаться в квадранте 4, а если происходит более прочное связывание с фермент-субстратным комплексом,
то Km уменьшается (как при бесконкурентном ингибировании), и прямые пересекутся в квадранте 3.
В табл. 2.3 представлены соотношения между основными пара-
метрами ферментативной реакции, характерные для разных типов ингибирования.
Таблица 2.3
Соотношение между параметрами ферментативной реакции
без ингибитора и в его присутствии (каж.)
Тип
ингибирования
Конкурентное
V
Смешанное
Бесконкурентное
Эк с пе р им е нта л ьн а я ч а с т ь
1. Провести контрольное культивирование дрожжей на питательной среде (ПС) с различными начальными концентрациями углеродного субстрата (этанола): 0,1 ; 0,3 и 0,5 %. Внесение остальных компонентов питательной среды проводить согласно указаниям в лабораторной работе 3.
Выращивание проводить в условиях периодического культиви-
рования с использованием перемешивающего устройства («качалки»). В процессе выращивания поддерживать следующие параметры: температура t = 36 oС, число оборотов n = 220 об/мин.
Параллельно провести культивирование дрожжей в присутствии
ингибитора. Для этого в питательные среды, приготовленные аналогично контрольным, внести 1 % раствор CuSO4*5Н2О. Параметры выращивания (скорость оборотов и температура) должны соответствовать
контрольным.
65
Данные табл. 2.4 демонстрируют схему приготовления питатель-
ной среды.
Таблица 2.4
Основные компоненты питательной среды для выращивания
дрожжей с концентрацией этилового спирта 1% (об.)
Состав питательной среды
Основная
питатель-
ная среда,
мл
Раствор
микро-
элемен-
тов, мл
Раствор
витами-
нов, мл
Эта-
нол,
1 %
(об.)
рас-
твор
Инокулят, мл
1 % рас-
твор
CuSO4×5
Н2О, мл
Контроль
(без инги-
битора)
200
0,2
0,2
2
20
–
Опыт
(с инги-
битором)
200
0,2
0,2
2
20
0,5
При приготовлении питательной среды с концентрациями
0,3 и 0,5 % (об.) в питательную среду необходимо вносить 6 и 10 мл
этилового спирта соответственно. Полученные растворы разлить по
20 мл в качалочные колбы.
2. Рост биомассы в опытных и контрольных вариантах контроли-
ровать по оптической плотности D. Анализ провести с использованием
фотоэлектрокалориметра при длине волны 540 нм.
Ра с че т но - а н а ли т ич е ск а я ч а с т ь
1. Для определения логарифмической фазы роста построить полулогарифмическую зависимость lnD от времени.
2. Определить значения удельной скорости роста на протяжении логарифмической фазы роста (три значения для контрольных ферментаций и три – для опытных при трех различных концентрациях субстрата).
3. Результаты свести в табл. 2.5. (Значения концентрации субстрата (этанола) для построения зависимостей Лайнуивера–Берка следует представить в г/л с учетом плотности этанола 0,8 г/см3 при температуре 20 оС.)
66
Таблица 2.5
Экспериментальные данные и расчетные показатели серии
ферментаций
№
про-
бы
τ, ч
Значения D
Значения µ, ч -1,
для логарифмической
фазы роста
S,
г/л
1/S
1/µ
без ингибит.
с ингибит.
без ингибит.
с ингибит.
Результаты ферментаций с начальной концентрацией этанола 0,1 %
1 0
2 3
3 6
4 9
5
12
Результаты ферментаций с начальной концентрацией этанола 0,3 %
1 0
2 3
3 6
4 9
5
12
Результаты ферментаций с начальной концентрацией этанола 0,5 %
1 0
2 3
3 6
4 9
5
12
1. Построить зависимости Лайнуивера–Берка (1/µ = f (1/S)) и гра-
фически определить тип ингибирования. При построении графика экспериментальные значения аппроксимировать линейным многочленом
(например, построить линейный тренд к точечному графику в MS Excel
и показать уравнение тренда на графике-диаграмме).
2. Графически и алгебраически (пользуясь уравнением тренда)
определить параметры уравнения Моно µ
max
и KS.
3. Определить значение константы ингибирования
Ко н т р о л ьн ы е во п ро с ы
1. Какие исследовательские цели могут быть достигнуты путем
применения метода «острых опытов»?
67
2. Назовите основные требования к условиям применения метода
«острых опытов» при периодическом культивировании.
3. Объясните механизм действия неспецифического ингибитора.
4. Объясните механизм действия специфического ингибитора.
5. Почему является оправданным использование уравнений фер-
ментативной кинетики для описания действия ингибиторов на микробные культуры?
6. Приведите примеры использования неспецифического ингибитора.
7. В чем заключается физический и математический смыслы кон-
станты Михаэлиса?
8. Объясните механизм действия ионов тяжелых металлов на
микробные культуры.
9. Какой способ культивирования (периодический или непрерыв-
ный) позволяет клеткам выдерживать более высокие концентрации ингибиторов?
10. Объясните характер графиков для различных типов ингибирования (конкурентного, неконкурентного, смешанного).
Ли т ер а ту р а
1. Работнова, И. Л. Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов / И. Л. Работнова,
И. Н. Позмогова. – Москва: Наука, 1979. – 208 с.
2. Рогачева, С. М. Биомолекулы. Строение, свойства, функции:
учебное пособие / С. М. Рогачева. – Саратов: Изд-во Саратов. гос. техн.
ун-та, 2014– 84 с.
3. Кузнецова, Е. А. Ферменты: структура, свойства и применение: учебно-методическое пособие / Е. А. Кузнецова, Л. В. Черепнина. – Орел: Изд-во ФГБОУ ВПО «Госуниверситет–УНПК», 2013 –
175 с.
4. Гамаюрова, В. С. Ферменты. Лабораторный практикум: учебное пособие / В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева. – Санкт-Петербург:
Проспект Науки, 2017. – 256 с.
5. Технология и промышленное использование ферментных
препаратов: методические рекомендации по выполнению контрольной работы, практических занятий и организации самостоятельной
работы студентов / сост. Н. А. Шавыркина. – Бийск: Изд-во Алт. гос.
техн. ун-та, 2018. – 30 с.
6. Основы энзимологии / В. В. Асеев. https://teachin.ru/file/synopsis/pdf/enzymology-M.pdf
7. Ферменты. Иллюстрированная биохимия (формулы, схемы,
термины и алгоритм познавания предмета)// tvgmu.ru:[сайт] –
URL:https://tvgmu.ru/upload/iblock/cce/FERMENTY.pdf. Дата обраще-
ния: 22.05.2018.
8. Бландов, А. Н. Кинетика ферментативных реакций: уч.-метод.
Пособие / А. Н. Бландов. – Санкт-Петербург: Изд-во Ун-та ИТМО,
2015. – 30 с.
9. Сироткин, А. С. Теоретические основы биотехнологии:
учебно-методическое пособие / А. С. Сироткин. – Казань: Изд-во
КНИТУ, 2010. – 87 с.
10. Химия и биотехнология. Задачи и решения: учебное пособие /
А. Н. Иванкин, Г. Л. Олиференко, О. П. Прошина, Ю. Н. Жилин. –
Москва: Изд-во ФГБОУ ВО МГУЛ, 2016. – 400 с.
11. Математическое моделирование биотехнологических процессов: методические указания к практическим занятиям / сост.
П. В. Миронов. – Красноярск: Изд-во Сиб. фед. ун-та, 2013. – 29 с.
68
Р А С Ч Е Т Н Ы Е З А Д А Ч И
t, ч
D, ед. опт. пл.
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
4,0
0,030
0,070
0,136
0,262
0,330
0,401
0,450
Концентрация
этанола, мМ/л
Удельная скорость
роста , ч-1
Концентрация
уксусной
кислоты, мМ/л
Удельная ско-
рость роста , ч-1
1
3
5
7
9
11
0.2
0.3
0.333
0.370
0.383
0.400
1
2
4
7
10
14
0,140
0,217
0,283
0,300
0,310
0,310
К у л ь т и в и р о в а н и е м и к р о о р г а н и з м о в
1. При изучении роста культуры микроорганизмов в периодиче-
ских условиях были получены следующие экспериментальные данные:
Определите удельную скорость роста этих микроорганизмов.
2. Определите максимальную удельную скорость роста
и константу субстратного насыщения Ks для роста дрожжей Candida
utilis на среде с этанолом и уксусной кислотой на основании следующих экспериментальных данных:
3. Определите предельное накопление биомассы, если начальная
концентрация биомассы Xo = 0,1 г/л; экономический коэффициент
Ys = 1; начальная концентрация субстрата So = 100 г/л.
69
max
70
4. При изучении роста культуры микроорганизмов были полу-
чены следующие экспериментальные данные при различных исходных
концентрациях субстрата (где t – время, Х – концентрация биомассы,
S – концентрация субстрата):
t, ч
Х, г/л
S, мМ/л
0
0,058
16,3
0,5
0,058
16,0
1,0
0,078
15,5
1,5
0,100
15,0
2,0
0,127
14,2
2,5
0,143
13,4
3,0
0,169
12,5
3,5
0,192
11,4
t, ч
Х, г/л
S, мМ/л
4,0
0,214
10,1
4,5
0,253
8.5
5,0
0,299
7,2
5,5
0,331
5,0
6,0
0,403
2,6
6,5
0,473
0,3
7,5
0,513
8,0
0,513
Определите максимальную удельную скорость роста
max
, кон-
станту насыщения субстрата Ks, константу ингибирования Ki, если выход субстрата I = 0,1.
5. Определите удельную скорость роста , если время, за которое
концентрация биомассы достигает половины максимальной, составляет
30 ч, а отношение максимальной концентрации биомассы к начальной
концентрации биомассы Хm/Xo = 100.
6. Определите удельную скорость роста , если отношение
Хm/Xo = 200 (где Хm – максимальная концентрация биомассы,
Xo – начальная концентрация биомассы), а время, за которое концентрация биомассы достигает половины максимальной, равно 10 ч.
7. Определите, какую часть максимальной скорости ферментативной реакции Vmax будет составлять скорость реакции при концентрациях субстрата, соответствующих 0,5; 2 и 10 значениям константы
субстратного насыщения Ks.
8. Для культуры микроорганизмов были определены следующие
кинетические параметры: константа субстратного насыщения
Ks = 5 г/л; экономический коэффициент Ys = 0,5; максимальная удель-
ная скорость роста
ma x
= 0,35 ч-1.
Определите значение максимальной производительности фер-
ментера при начальной концентрации субстрата So = 20 г/л
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]