Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биотехнологии и асептики проведения процессов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Эк с пе р им е нта л ьн а я ч а с т ь
1. Произвести отбор проб воздуха седиментационным и аспира-
ционным методами для определения содержания в нем микроорганизмов. С этой целью взять две чашки Петри с МПА, подписать их. Одну
чашку раскрыть, сдвигая крышку на самый край бортика так, чтобы вся
поверхность агаризованной среды была полностью открыта. Чашку
оставить открытой на 5 мин. Затем закрыть ее крышкой, перевернуть
вверх дном и поместить в термостат при 37 °С на 24–48 ч. Вторую
чашку Петри без крышки закрепить на диске прибора Кротова, установить скорость прокачивания воздуха 25 л/мин и отметить начальное
время аспирации. Включить прибор и произвести забор 100 л воздуха.
Чашу также поместить в термостат для инкубации в течение 24–48 ч
при 37 °С. Одной подгруппе следует отобрать шесть проб воздуха
(по три каждым способом).
2. Произвести очистку воздуха через воздушный фильтр и определить коэффициент проскока. С этой целью собрать установку согласно схеме 1.6.
Рис. 1. 6. Схема лабораторной установки: 1 – компрессор
с регулированием расхода воздуха; 2 – ротаметр; 3 – фильтр;
4 – чашки Петри с МПА
Перед началом отбора проб воздуха следует путем прямых заме-
ров с помощью штангенциркуля определить геометрические размеры
слоя фильтрующего материала в воздушном фильтре 3, внутренний
диаметр шланга и с помощью ротаметра 2 при включении компрессора
1 – расход воздуха.
31
Включить компрессор 1, установить расход по ротаметру 2 (поль-
зуясь табл. 1.5 и направить струю очищенного воздуха на поверхность
пластины МПА в приоткрытую чашку Петри. Выходное отверстие
шланга следует расположить между двумя работающими горелками.
Запись в лабораторном журнале выполнить по определенной
форме (табл. 1.4).
Таблица 1.4
Результаты экспериментального исследования
Засеянные чашки Петри поместить в термостат для культивирования на 48 ч при температуре 30 °С. По истечении времени следует
произвести анализ посевов и рассчитать ряд показателей, характеризующих изучаемый процесс воздухоочистки.
Режимы работы установки представлены в табл. 1.5.
Таблица 1.5
Режимы работы установки
Ра с че т но - а н а ли т ич е ск а я ч а с т ь
Произвести подсчет количества колоний в чашках, вычислить
площадь питательной среды в них и рассчитать общее количество микроорганизмов по формулам, соответствующим данному методу. Заполнить таблицу по определенной форме (табл. 1.6).
32
Таблица 1.6
Результаты анализа общей обсемененности воздуха
Скорость воздушного потока Vвп рассчитать для пяти вариантов
расхода воздуха по формуле
где Qi – расход воздуха, м3/с; Д – диаметр отверстия шланга, м.
Заполнить итоговую таблицу (табл. 1.7).
Таблица 1.7
Результаты лабораторной работы
33
Выполнить графическую зависимость Kп = f (Vв). Рассчитать толщину фильтрующего слоя Н90, необходимую для улавливания 90 % частиц от их начального содержания х0, по формуле
Сделать выводы по результатам лабораторной работы.
Ко н т р о л ьн ы е в о пр о с ы
1. Каким образом влияет загрязненный воздух на показатели био-
технологического производства?
2. Назовите наиболее широко применяемые методы микробиоло-
гического анализа воздуха.
3. Назовите основных представителей воздушной микрофлоры.
4. Какие питательные среды могут быть использованы для выде-
ления микроорганизмов из воздуха?
5. Назовите наиболее эффективные методы очитки воздуха.
На каком принципе действия они основаны?
6. Каким образом можно получить стерильный воздух? На каких
стадиях биотехнологического производства реализуются методы получения стерильного воздуха?
7. Какой показатель применяют для оценки эффективности сте-
рилизации воздуха? От каких факторов зависит его величина?
8. Какие факторы учитываются в уравнении модели фильтрова-
ния воздуха?
9. Каким образом достигается равномерное распределение воз-
душного потока по поверхности чашки Петри в аппарате Кротова?
10. Объясните физический смысл обратной зависимости количе-
ства микробных клеток и времени экспозиции в формуле Омелянского.
11. Какие компоненты входят в состав используемой лаборатор-
ной установки?
12. На основании каких экспериментальных данных получают
расчетные параметры загрязненности воздуха?
13. Принципы измерения расхода воздуха в аппарате Кротова
и лабораторной установке.
14. Объясните физический смысл показателя Н90.
15. Каким образом коэффициент проскока зависит от скорости
воздушного потока?
34
Ли т ер а ту р а
1. Винаров, А. Ю. Процессы и аппараты биотехнологии: фермен-
тационные аппараты: учебное пособие для вузов / А. Ю. Винаров; под
ред. В. А. Быкова. – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва: Юрайт, 2020. –
274 с.
2. Теоретические основы пищевой биотехнологии: лабораторные
работы / О. В. Зюзина, О. Б. Шуняева, Е. И. Муратова, О. О. Иванов. –
Тамбов: Изд-во Тамбов. гос. техн. ун-та, 2006. – 48 с.
3. Луканин, А. В. Инженерная биотехнология: основы технологии микробиологических производств: учебное пособие. – Москва:
НИЦ ИНФРА-М, 2016. – 312 с.
4. Манаков, М. Н. Теоретические основы технологии микробиологических производств / М. Н. Манаков, Д. Г. Победимский. – Москва:
Агропромиздат, 1990. – С. 97–99; 173–205.
5. Сироткин, А. С. Теоретические основы биотехнологии:
учебно-методическое пособие : / А. С. Сироткин, В. Б. Жукова. – Казань: Изд-во КНИТУ, 2010. – 87 с.
6. Теоретические основы пищевой биотехнологии: лабораторные
работы / О. В. Зюзина, О. Б. Шуняева, Е. И. Муратова, О. О. Иванов. –
Тамбов : Изд-во Тамбов. гос. техн. ун-та, 2006. – 48 с.
7. Кочеровец, В. И. Введение в фармацевтическую микробиологию: учебное пособие / В. И. Кочеровец. – Санкт-Петербург: Проспект
Науки, 2014. – 240 c.
8. Тихомирова, О. М. Основы промышленной асептики. /
О. М. Тихомирова; // ЭИОС СПХФУ: [сайт]. – URL:
https://eduspcpu.ru/course/view.php?id=1044. – Дата обращения
21.10.2022.
35
Т е м а 2 . К У Л Ь Т И В И Р О В А Н И Е Д Р О Ж Ж Е Й
НА Р А З Л И Ч Н Ы Х О Р Г А Н И Ч Е С К И Х С У Б С Т Р А Т А Х
Те о ре т ич е ск а я ч ас т ь
С точки зрения биохимии живая клетка представляет собой очень
сложную систему, в которой одновременно протекает более 1000 биокаталитических процессов превращения веществ. Пространственному
разделению этих процессов способствует компартментализация
клетки. Совокупность всех реакций, которые проходят в клетке, называется метаболизмом клетки.
Все процессы, происходящие в клетке, схематично можно раз-
делить на две группы. Одни направлены на получение энергии. Они
получили название катаболитических. В ходе этих реакций происходит превращение сложных соединений (углеводов, белков и др.)
в простые (например, СО2 и Н2О), которое сопровождается снижением степени полимеризации метаболизируемых соединений за счет
разрушения цепочки углеродных атомов. Такой процесс получил
название десмолиза. Параллельно протекают окислительно-восстановительные реакции. В результате такого рода реакций происходит образование энергии в форме АТФ.
Другая совокупность клеточных реакций связана с синтезом слож-
ных, в большинстве случаев полимерных соединений (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) из более простых. Эти соединения используются клеткой для построения основных компонентов клетки. Эти процессы получили название биосинтетических или анаболических. Они
протекают с затратой энергии в виде АТФ. Высокомолекулярные соединения в метаболизме клетки образуются из более простых. Например,
белки синтезируются из аминокислот, полисахариды – из сахаров и т. д.
Эти соединения могут выступать в качестве компонентов питательной
среды. В таком случае они транспортируются в клетку с использованием
механизмов активного транспорта или облегченной диффузии. В случае
их отсутствия в питательной среде организм синтезирует их сам.
Процессы биосинтеза низкомолекулярных веществ, таких как аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, являющихся компонентами для
биосинтеза биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов), называются амфиболическими, а их совокупность –
36
37
амфиболизмом клетки. Амфиболические процессы обеспечивают клетку
энергией и исходными для анаболизма веществами.
Метаболические процессы и реакции в клетке объединяются
в определенные последовательности, называемые путями метаболизма.
В результате анаболизма и амфиболизма синтезируются первичные
и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты – это продукты метаболизма, необходимые для роста микроорганизмов и выступающие
в качестве строительных блоков макромолекул и коферментов. К ним
относятся аминокислоты, витамины, ферменты, органические кислоты
и др. Вторичные метаболиты – это продукты метаболизма, в которых
микроорганизмы не нуждаются для собственного роста. К ним относятся антибиотики, токсины, алкалоиды и др.
Биохимические особенности роста микроорганизмов на углеводах. В биотехнологии под субстратом понимается органическое или
неорганическое вещество, взаимодействующее с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса, в результативном случае
приводящего к получению продуктов ферментативной реакции. Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо размножаются на питательных средах, в которых в качестве органического субстрата используются углеводы. Причем полисахариды предварительно расщепляются до моносахаридов внеклеточными ферментами. Наиболее хорошо микроорганизмы используют гексозы (глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сахарозу и др.).
В клетке метаболизация субстрата происходит с использованием
следующих путей: Эмбдена–Мейергофа–Парнаса, пентозофосфатного,
Энтнера–Дудорова и др. При этом общий принцип метаболизма субстратов состоит в том, что клетки могут использовать субстрат с помощью нескольких путей катаболизма одновременно для обеспечения
своего оптимального развития. Чаще всего используется метаболический путь Эмбдена–Мейергофа–Парнаса (ЭМП).
Катаболизм глюкозы по пути ЭМП включает 10 биокаталитических стадий (рис. 2.1).
Исходным субстратом является глюкоза, конечным продуктом –
пировиноградная кислота (ПВК, пируват). Катаболизм глюкозы состоит в ее фосфорилировании, а также фосфорилировании промежуточных соединений с накоплением максимума энергии субстрата
внутри клетки, поскольку сильно ионизированные органические вещества не диффундируют через клеточную мембрану из клетки и являются источником энергии для конструктивного и энергетического
38
обмена. Накопление внутриклеточной энергии вследствие присоединения фосфатной группы HPO42- к молекулам органического субстрата
называют субстратным фосфорилированием.
Рис. 2.1. Схема метаболического пути Эмбдена–Мейергофа–Парнаса
В процессе катаболизма глюкозы осуществляются энергозатратные реакции, когда изменение свободной энергии ∆G ≥ 0, а энергодающей реакцией для их протекания является сопряженная реакция гидролиза АТФ (рис. 2.1). Спонтанные реакции фосфорилирования АДФ
с образованием АТФ осуществляются, начиная с превращения двух молекул 3-фосфоглицеринового альдегида через ряд промежуточных продуктов в две молекулы пирувата (рис. 2.1). Таким образом, катаболизм
39
одной молекулы глюкозы с образованием двух молекул пирувата сопровождается первоначальным гидролизом двух молекул АТФ и последующим образованием четырех молекул АТФ.
В результате катаболизма глюкозы по пути ЭМП клетка получает
следующие преимущества:
– запасается химическая энергия (АТФ);
– образуются восстанавливающие эквиваленты (НАДН+Н+);
– синтезируются биосинтетические предшественники (ПВК).
Поэтому этот путь метаболизма является амфиболическим.
В клетках мышечных тканей и в молочнокислых бактериях путь
ЭМП не завершается образованием пирувата, пируват восстанавливается до молочной кислоты (лактата). Вся последовательность биохимических реакций, начинающая с глюкозы и завершающаяся молочной
кислотой, называется гликолизом.
Активность функционирования пути Эмбдена–Мейергофа–Парнаса во многом зависит от внешних условий, в частности от доступности
кислорода. Наиболее ярко эта тенденция прослеживается у дрожжей.
Дрожжи являются факультативными анаэробами. В отсутствие кислорода
они осуществляют брожение и получают энергию в результате субстратного фосфорилирования, связанного с превращением фосфоенолпирувата
в пируват. В присутствии кислорода они переходят на дыхание с задействованием дыхательной цепи. Образующаяся в этом случае энергия
в виде АТФ синтезируется в результате окислительного фосфорилирования. Эффект прекращения брожения в присутствии кислорода получил
название эффекта Пастера. Эффект объясняется разной энергетической
эффективностью метаболизма субстрата при брожении и дыхании. При
низкой концентрации кислорода продукт гликолиза – пируват – превращается в этанол и углекислоту с низким выходом энергии (2 моль АТФ на
моль глюкозы). Если концентрация кислорода высока, пируват превращается в ацетил-КоА, который затем может использоваться в цикле Кребса,
что увеличивает эффективность до 38 моль АТФ на 1 моль глюкозы.
В анаэробных условиях скорость метаболизма глюкозы быстрее,
но количество образованного АТФ (как уже было упомянуто), меньше.
В аэробных условиях скорость гликолиза уменьшается, так как повышение концентрации АТФ аллостерически ингибирует фермент фосфофруктокиназу 1 – третий фермент пути гликолиза. Таким образом, для
дрожжей более выгодно использование цикла Кребса в аэробных условиях, так как для синтеза большего количества АТФ требуется меньшее
количество глюкозы.
40
Метаболизм этанола. Первичное окисление этанола происходит
по другой схеме. На этом этапе метаболизма этанола последовательно
задействованы два фермента: НАД-зависимая алкогольдегидрогеназа
и НАД-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа. Первый фермент локализован в митохондриях и ответствен за проведение реакций окисления
этанола в ацетальдегид:
В цитоплазме обнаружен еще один тип дегидрогеназы, которая
катализирует протекание обратной реакции превращения ацетальдегида в этанол. Этот процесс обычно отмечается для анаэробных условий, в которых протекает спиртовое брожение, в то время как описанная реакция доминирует при аэробном росте дрожжей на этаноле.
Ацетальдегид, в свою очередь, под действием НАД-зависимой
альдегиддегидрогеназы превращается в ацетилкофермент А:
В результате двухступенчатого окисления этанола образуется
2 моль НАДН из 1 моль этанола. При недостатке кислорода клетка может выделять в окружающую среду уксусную кислоту, которая образуется за счет конверсии ацетилкофермента.
Биохимическая целесообразность этих реакций состоит в том,
что если клетка испытывает дефицит кислорода, то она может снизить
потребность в нем за счет выделения уксусной кислоты в культуральную жидкость.
При аэробном дыхании на окисление 1 моль этанола затрачивается 1 моль кислорода и синтезируется 5 моль АТФ.
Ацетилкофермент А, синтезированный в клетке в нормальных
условиях, включается в ЦТК при конденсации с оксокислотами. Часть
ацетил-КоА вовлекается в так называемый глиоксилатный шунт.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]