Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биотехнологии и асептики проведения процессов. Учебно-методическое пособие
.pdf
51
Количество глюкозы в гидролизате вычисляют по формуле
m1 = С МГ р / 1000,
где МГ – молекулярная масса глюкозы; р – коэффициент, учитывающий количество разбавлений гидролизата; 1000 – коэффициент пересчета в моли.
Выявление гликогена. На предметном стекле приготовить препарат «раздавленная капля». Добавить каплю раствора Люголя. Микроскопировать под увеличением в 40 раз. Гликоген в дрожжевых клетках
окрашивается в красновато-бурый цвет.
Определение количества белка в биомассе. Метод основан на том
факте, что спектрофотометрически максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм. Он обусловлен присутствием в белках ароматических
аминокислот – тирозина и триптофана. Диапазон колебаний отношений
их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок.
При определении содержания белка в дрожжевых клетках сначала проводят гидролиз дрожжей с экстракцией белков. Для этого надо
внести 1 мл дрожжевой культуры в мерные колбы на 50 мл, добавить
20 мл 0,5 н NаОН и нагревать на кипящей водяной бане. Засекают время
закипания. Затем пробы охлаждают и доводят объем до 50 мл 0,5 н раствором NаОН. Остатки клеток удаляют центрифугированием. Одновременно обрабатывают контрольную пробу. Для этого нужно внести
20 мл 0,5 н NаОН, прокипятить на водяной бане 20 мин, довести объем
до 50 мл 0,5 н NаОН.
В надосадочной жидкости с помощью спектрофотометра определяют оптическую плотность при λ = 280 нм и 260 нм. При каждой длине
волны измерения проводят относительно контрольной пробы.
Если
, то концентрацию белка определяют по сле-
дующей формуле: Б = 1,45 А
280
– 0,74 А
260
, где А
280
и А
260
– оптическая
плотность при 280 и 260 нм соответственно; Б – содержание белка
в биомассе, % вес.
Зная концентрацию биомассы в культуральной жидкости, можно
определить концентрацию белка в биомассе.
Ра с че т но - а н а ли т ич е ск а я ч а с т ь
1. Используя экспериментальные данные, построить кривую роста
дрожжей в периодических условиях культивирования и определить длительность основных фаз (лаг-фазы, log-фазы, фазы стационарного роста).
2. Построить и проанализировать график зависимости концен-
№ пробы
τ, ч
Х, г/л
S, г/л
Наличие
гликогена
0 0 1 2 2 4 3 6 4 8 5
24
Фазы роста
Продолжительность
фаз роста, ч
µ, ч-1
q,
г/(г.ч)
Y
x/s,
г АСБ/г
субстрата
Б,%
Лаг-фаза
Фаза ускорения
роста
Логарифмическая
фаза
Фаза замедления
роста
Стационарная
фаза
Фаза отмирания
трации органического субстрата в среде от времени.
Вычислить значения удельной скорости роста µ по фазам роста.
3.
4. Рассчитать значения экономического коэффициента и метабо-
лического коэффициента по фазам роста.
5. Вычислить значения выхода по энергии, кислороду и белку для
процесса культивирования дрожжей, формулу биомассы которых принять по Стоутхамеру СН
1,8O0,5N0,2
.
Результаты экспериментальных исследований и расчетов свести
в табл. 2.1 и 2.2.
Таблица 2.1
Экспериментальные данные, полученные при культивировании
дрожжей
Таблица 2.2
Расчетные показатели культивирования дрожжей по фазам роста
52
53
По полученным данным построить зависимости изменения пара-
метров роста от удельной скорости роста. Сделать выводы по проделанной работе.
Ко н т р о л ьн ы е во п ро с ы
1. Назовите основные различия периодического и непрерывного
культивирования.
2. Какие фазы размножения проходит биомасса клеток в условиях периодического культивирования?
3. Какие показатели используют для характеристики процессов
роста популяции микроорганизмов?
4. В каких единицах измеряется удельная скорость роста, общая
скорость роста?
5. Как можно изменить удельную скорость роста?
6. С помощью какого устройства регулируется температура про-
цесса?
7. Какова доза посевного материала?
8. В чем сущность метода определения углеродсодержащего суб-
страта в работе?
9. Какой метод используется для определения концентрации био-
массы?
10. Рассчитайте, какое количество биомассы будет накоплено
к десятому часу роста, используя определенную вами среднюю удельную скорость роста.
Ли т ер а ту р а
1. Винаров, А. Ю. Процессы и аппараты биотехнологии: ферментационные аппараты: учебное пособие для вузов / под ред. В. А. Быкова. – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва: Юрайт, 2020. – 274 с.
2. Алешина, Е. С. Культивирование микроорганизмов как основа
биотехнологического процесса: учебное пособие / Е. С. Алешина,
Е. А. Дроздова, Н. А. Романенко. – Оренбург: Изд-во Оренбург. гос. ун-та,
ЭБС АСВ, 2017. – 192 с.
3. Мухачев, С. Г. Методика лабораторного культивирования
аэробных микроорганизмов и определение энергетических параметров
микробного роста : учебное пособие / С. Г. Мухачев. – Казань: Изд-во
КНИТУ, 2011. – 78 с.
4. Безбородов, А. М. Микробиологический синтез / А. М. Безбородов. – Санкт-Петербург: Проспект науки, 2011. – 140 с.
5. Римарева, Л. В. Теоретические и практические основы биотехнологии дрожжей: учебник для вузов / Л. В. Римарева. – Москва:
ДеЛи принт, 2010. – 252 с.
6. Биотехнология / И. В. Тихонов, Е. А. Рубан, Т. Н. Грязнева
[и др.]; под ред. Е. С. Воронина. – Санкт-Петербург: ГИОРД, 2008. –
704 с.
7. Луканин, А. В. Инженерная биотехнология: основы технологии микробиологических производств: учеб. пособие / А. В. Луканин. –
Москва: НИЦ ИНФРА-М, 2016. – 312 с.
8. Манаков, М. Н., Теоретические основы технологии микробиологических производств / М. Н. Манаков, Д. Г. Победимский. – Москва:
Агропромиздат, 1990.
9. Сироткин, А. С. Теоретические основы биотехнологии:
учебно-методическое пособие / А. С. Сироткин, В. Б. Жукова. – Казань:
Изд-во КНИТУ, 2010. – 87 с.
54
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 4
И З У Ч Е Н И Е В Л И Я Н И Я И Н Г И Б И Т О Р О В Н А Р О С Т
М И К Р О Б Н О Й К У Л Ь Т У Р Ы
Цель и задачи работы: получение комплекса экспериментальных
данных, характеризующих влияние ионов тяжелых металлов (на примере ионов меди) на рост микробной культуры и определить тип ингибирования.
Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:
– посевной материал – суспензия дрожжей (р. Saccharomyces
или p. Candida) – 200–300 мл на весь эксперимент;
– перемешивающее устройство (качалка) – 2, 4, 6 шт.;
– весы – 2 шт.;
– фотоэлектроколориметр (2 шт.) и кюветы (на 5 мл);
– качалочные колбы (9 шт. на одну качалку) объемом 100 мл;
– питательная среда с раствором микроэлементов и витаминов;
– этанол как субстрат (S = 0,1; 0,3 и 0,5 %);
– ингибитор – 1 % раствор CuSO4*5H2O;
– пипетки мерные объемом 10 мл – 6–8 шт.;
– пипетки мерные объемом 1 мл – 6–8 шт.;
– конические колбы объемом 250 мл – 6–8 шт.;
– пробирки со штативом (на один опыт, на одну бригаду) – 5–6 шт.;
– мерные колбы объемом 50 или 100 мл – 4 шт.;
– мерные колбы объемом 500 мл – 2 шт.;
Кр а тк и е т е о р е т и ч е с ки е св е де н ия
Обмен веществ представляет собой сложный комплекс взаимо-
связанных биохимических реакций, непрерывно протекающих в клетке
микроорганизма. Цель осуществления этих реакций заключается
в усвоении веществ из окружающей среды, метаболизации их в организме для получения энергии и биосинтетических составляющих, что
позволяет клетке поддерживать свое существование и осуществлять ростовые процессы. В ходе метаболизма часть продуктов может быть экскретирована в окружающую среду. В качестве таких соединений можно
рассматривать вторичные метаболиты, а также продукты распада компонентов питательной среды, являющиеся токсичными для клетки.
55
56
Структурно-функциональная организация биологических систем характеризуется гетерогенным характером, что обусловливает динамическую гетерогенность процессов метаболизма. На уровне метаболизма
клетки эта особенность находит свое выражение в том, что разные реакции протекают с разными характерными скоростями. Время протекания ферментативных процессов колеблется от 10-1 до 106 с. Кроме того,
подобная тенденция наблюдается для физиологической адаптации микроорганизма, которая может занимать от нескольких секунд до нескольких минут, а также для репродукции, длительность которой начинается от нескольких минут и может занимать достаточно длительные
временные промежутки.
Исходя из представленных рассуждений можно предположить
существование одной или ряда химических реакций, оказывающих
определяющее в динамическом отношении влияние на метаболизм
клетки в целом. Такие реакции получили название «узкого места» метаболизма.
Согласно принципу «узкого места» метаболизма общая скорость
превращения вещества во всей цепи реакции определяется наиболее
медленной стадией. Например в гликолизе определяющей является стадия Ф6Ф (фруктозо-6-фосфат)→ФДФ (фруктозодифосфат). В таком
случае модель упрощается – сводится к изучению поведения наиболее
медленной стадии. Воздействуя на медленное звено, можно управлять
всем процессом. Таким образом, скорость одной или ограниченного количества ферментативных реакций определяет кинетические закономерности роста клетки, а также всей культуры.
Использование понятия «узкого места» позволило применить основной инструментарий ферментативной кинетики для анализа действия ингибитора на рост микробной культуры. Традиционно в исследованиях ингибиторного влияния различных соединений на биологические объекты (особенно культуры микроорганизмов) применяются методы непрерывного культивирования. Наиболее наглядную информацию дают методы турбидостатной группы. Однако на практике использование таких методов слежения за физиологической реакцией исследуемой культуры на внешние параметры достаточно затруднительно
вследствие необходимости наличия специальной аппаратуры, сложности поддержания стерильности в процессе культивирования, высоких
требований, предъявляемых к обслуживающему персоналу, и др. Достойной альтернативой непрерывному выращиванию является использование периодического культивирования. Однако следует иметь
57
в виду, что анализу подлежат только данные, полученные в экспоненциальной фазе роста. Это объясняется тем, что именно в этой фазе создаются условия, обеспечивающие оптимальные условия для роста.
К ним относятся отсутствие недостатка в питательных веществах, незначительные количества токсичных продуктов метаболизма в культуральной жидкости, а также наличие свободного места в ферментере для
развития культуры.
Использование метода острых опытов позволяет провести исследование влияния ингибитора на поведение экспоненциально растущей
культуры. Такого рода исследования позволяют выявить механизм ингибирования биосинтеза микробных биополимеров (белков микробной
массы, липидов клетки, нуклеиновых кислот и др.). Методика проведения опыта предполагает первоначальное получение исследуемой культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста. Для этого проводят
периодическое культивирование до достижения этого состояния. Затем
к культуре добавляют ингибитор и проводят анализ кинетики роста
культуры. Длительность эксперимента может меняться от 1,5 до 6 ч
в зависимости от характеристик культуры, типа ингибитора, состава
питательной среды и т. п. Затем сравнивают экспериментальные данные, полученные в опыте и контроле.
При выполнении этого эксперимента следует обратить внимание
на подбор правильной дозы ингибитора. Большие дозы ингибитора
могу действовать сразу на несколько функций клетки, кроме того, при
их использовании возможно не только снижение ростовых характеристик культуры, но и полностью остановка метаболизма.
Большое значение также имеет длительность эксперимента. Чем
короче эксперимент, тем точнее получаемая информация. Это связано
с тем, что воздействие на одну биохимическую реакцию в силу сопряженности всего метаболизма быстро проявляется в виде изменения скорости прохождения других биохимических реакций. Кроме того, с учетом того, что в ходе периодического культивирования происходит постоянное изменение внешних условий, требование к как можно более
короткой длительности эксперимента является необходимым. При этом
в процессе исследований следят за выживаемостью не размножающихся клеток в присутствии ингибитора.
Опираясь на принцип «узкого места», можно использовать основные положения ферментативной кинетики для формализованного
описания реакции микробной культуры на действие ингибиторов.
58
Основные положения ферментативной кинетики. Основоположниками общей теории ферментативной кинетики являются Л. Михаэлис и М. Л. Ментен. Они впервые математически описали зависимость
активности фермента от концентрации субстрата. Эта зависимость
в настоящее время носит их имена и выглядит следующим образом:
где V – скорость ферментативной реакции; Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции; S – концентрация субстрата; Km – константа Михаэлиса.
Уравнение Михаэлиса–Ментен показывает зависимость скорости ферментативной реакции V от концентрации субстрата S. В графическом виде это выражение представляет собой равнобочную гиперболу. Скорость ферментативной реакции V стремится к максимуму
Vmax при увеличении концентрации субстрата S. Однако рост скорости
реакции носит асимптотический характер. Поэтому использование такой зависимости для точного определения характеристических параметров Vmax и Km является нежелательным вследствие появления
большой ошибки.
Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Михаэлиса–Мэнтен в обратные координаты. Это уравнение теперь носит их имена:
При решении уравнения Михаэлиса–Ментен можно получить
три варианта:
1. Концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса
(S = Km). Тогда решение уравнения Михаэлиса–Ментен позволяет получить следующую зависимость: V = ½ Vmax
Таким образом, физический смысл константы Михаэлиса заключается в том, что она соответствует той концентрации субстрата, при
которой скорость ферментативной реакции соответствует половине
своего максимального значения. В биологическом смысле константа
Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату. Чем меньше
Кm, тем выше сродство к субстрату, а значит, при более низких концен-
трациях субстрата достигаются более высокие скорости ферментативной реакции.
2. Концентрация субстрата значительно больше Km (S >> Km).
В этом случае величиной Km можно пренебречь. Решение уравнения
приводит к тому, что скорость реакции будет соответствовать максимальной (на графике этот случай можно представить в виде плато,
наблюдаемого при высоких концентрациях субстрата).
3. Концентрация субстрата значительно меньше Km (S << Km).
В этом случае знаменатель уравнения мало изменяется при изменении
S, а величина скорости реакции V прямо пропорциональна S (график
линеен).
На рис. 2.4 и 2.5 представлены рассматриваемые ситуации в ко-
ординатах Михаэлиса–Ментен и Лайнуивера–Берка
Рис. 2.4. График уравнения Михаэлиса–Ментен
Рис. 2.5. График уравнения Лайнуивера–Берка
Ингибирование ферментов. Ингибиторами называются соеди-
нения, вызывающие снижение скорости ферментативной реакции при
введении их в реакционную смесь. Существует несколько классификаций ингибиторов. Одна из них делит все ингибиторы на обратимые
и необратимые. Необратимые ингибиторы иногда называют каталитическими ядами. Для них характерна полная потеря каталитической
59
60
активности фермента в присутствии ингибитора. Часто наличие ингибиторов в реакционной среде даже в незначительных количествах значительно искажает результаты эксперимента. Обратимые ингибиторы
могут образовывать динамически обратимые комплексы с субстратом,
которые отличаются по своим каталитическим свойствам от свободного фермента.
По отношению ингибитора к активному центру фермента обра-
тимое ингибирование делят на конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное и смешанное.
Конкурентное ингибирование. В этом случае ингибитор по сво-
ему строению имеет много общего с субстратом. Поэтому он может выступать конкурентом субстрату за возможность связывания с активным
центром фермента. В результате активный центр не снижает своей каталитической активности, но снижается его доступность. Возможность
снизить или в некоторых случаях даже снять конкурентное ингибирование связана с использованием избытка субстрата. При данном ингибировании максимальная скорость реакции остается вполне достижимой при создании высоких концентраций субстрата.
В качестве примера такого ингибирования можно привести ис-
пользование сульфаниламинов при лечении ряда заболеваний бактериальной этиологии. Известно, что структура сульфаниламинов и парааминобензойной кислоты схожа. Кроме того, известно, что пара-аминобензойная кислота является обязательным компонентом фолиевой
кислоты, которая выступает в качестве активного центра многих ферментов. Причем фолиевая кислота de nоvo может синтезироваться
только микроорганизмами. У человека такая возможность отсутствует.
Поэтому при приеме таких препаратов человеком возникает конкуренция у микроорганизмов между сульфаниламином и пара-аминобензойной кислотой. Наблюдаемый бактериостатический эффект обусловлен
снижением синтеза фолиевой кислоты и связанным с этим резким ухудшением микробного метаболизма.
При конкурентном ингибировании не происходит изменения
максимальной скорости ферментативной реакции. Вместе с тем сродство субстрата к ферменту снижается, что ведет к росту константы Михаэлиса (Km) в (1 + [I]/Ki) раз ([I] – концентрация ингибитора, Ki – кон-
станта ингибирования).
На рис. 2.6 и 2.7 представлено влияние конкурентного ингиби-
тора на прохождение ферментативной реакции.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]