Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биотехнологии и асептики проведения процессов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Глиоксилатный шунт представляет собой обходной путь реакций превращения изолимонной кислоты в яблочную (рис. 2.2). Если в цикле Кребса
изолимонная кислота путем двух стадий декарбоксилирования последовательно превращается через α-кетоглютаровую кислоту в янтарную кислоту, а затем в яблочную, то при окислении этанола с включением глиоксилатного шунта эти две стадии декарбоксилирования отсутствуют.
Рис. 2.2. Биохимическая схема ассимиляции органических субстратов
дрожжами
41
Изолимонная кислота путем альдольного расщепления превращается в янтарную и глиоксиловую кислоты. Эту реакцию катализирует изоцитратлиаза. Глиоксиловая кислота путем конденсации с ацетил-КоА образует яблочную кислоту под действием малатсинтазы. Таким образом, при каждом обороте цикла за счет включения второй молекулы ацетил-КоА синтезируются дополнительные молекулы яблочной кислоты (рис. 2.2). Она используется клеткой для биосинтеза фосфоенолпирувата с «замыканием» метаболических путей утилизации источников углерода.
В случае когда некоторая часть ацетил-КоА включается в глиоксилатный шунт, сразу превращаясь в яблочную кислоту, большая часть
цитоплазматического НАДН включается в окисление этанола, так что
яблочная кислота (малат) превращается скорее в пировиноградную кислоту (пируват), необходимую для синтеза клеточных компонентов и роста микроорганизма, чем в щавелевоуксусную кислоту, которая требует
НАД. Когда концентрация этанола уменьшается и зкстрацеллюлярная
уксусная кислота «возвращается» в клетку, вследствие сдвига в ацетатном равновесии увеличивается доля НАД. Последний включается
в конверсию яблочной кислоты в щавелевоуксусную, что приводит
к увеличению концентрации ацетил-КоА через полный ЦТК.
Следовательно, при низких концентрациях этанола и высоких
концентрациях уксусной кислоты большая часть субстрата утилизируется скорее для поддержания клеточной жизнедеятельности, чем для
роста клеток. Отметим, что на синтез и активность алкогольдегидрогеназы оказывают репрессирующее и ингибирующее действие образующиеся продукты метаболизма – ацетальдегид и уксусная кислота.
42
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 3
К И Н Е Т И К А И С Т Е Х И О М Е Т Р И Я Р О С Т А
М И К Р О О Р Г А Н И З М О В В П Р О Ц Е С С Е И Х
П Е Р И О Д И Ч Е С К О Г О К У Л Ь Т И В И Р О В А Н И Я
НА Г Л Ю К О З Е И Э Т А Н О Л Е
Цель работы: получение экспериментальных данных, характеризующих периодический процесс роста дрожжей на глюкозе, этаноле,
и их анализ.
Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:
– музейная культура дрожжей – 2–3 пробирки;
– суспензия дрожжей Candida utilis – 20–50 мл;
– микроскопы.;
– газовый хроматограф;
– спектрофотометр;
– фотоэлектроколориметр;
– центрифуга (8000 мин-1);
– водяная баня;
– электроплитка;
– весы аналитические;
– миксер микробиологический;
– качалочные колбы;
– минеральные соли: NH4H2PO4; (NH4)2SO4;
MgSO4 * 7 H2O; Na2HPO4*12H2O; KH2PO4;K2HPO4; FeSO4;
MnSO4; ZnSO4; NaCl; СаCl2 * 4 H2O; K2Cr2O7; FeSO4*(NH4)2SO4;
K3Fe(CN)6; NаОН; СuSO4 * 5H2O; COOK-CHOH-CHOH-COONa*4H2O;
KJ; Na2S2O3.
– H2SO4 (конц.);
– этанол;
– глюкоза;
– дрожжевой автолизат;
– раствор Люголя;
– 0,5 % раствор крахмала;
– пипетки мерные объемом 1 мл;
– пипетки мерные объемом 2 мл – 5–10 шт.;
– конические колбы объемом 250 мл – 5 шт.;
– пробирки со штативом (на один опыт на одну бригаду) – 8–10 шт.;
– мерные колбы объемом 50 или 100 мл (на бригаду) – 4–5 шт.;
43
44
– мерные колбы объемом 500 мл (1000 мл) – 2 шт.;
– бюретки объемом на 50 мл (100 мл) – 2 шт.;
– круглодонная колба с резиновой пробкой и газоотводной трубкой объемом 50–75 мл – 1–2 шт.;
– приемная колба – 1–2 шт.;
– предметные стекла – 10 шт.;
– покровные стекла – 10 шт.;
– марлевые салфетки;
– фильтровальная бумага.
Кр а тк и е т е о р е т и ч е с ки е св е де н ия
Периодическое культивирование микроорганизмов – наиболее
простой с точки зрения техники метод культивирования. В этом случае
в качалочную колбу или ферментатор помещается питательная среда,
в которую вносится активная культура микроорганизмов – инокулят
(от лат. inoculatio – прививка). Инокулят иначе называют посевным материалом, а инокуляцию – посевом. В дальнейшем наблюдают за ростом и накоплением микроорганизмов в питательной среде.
Рост микроорганизмов наблюдается до тех пор, пока концентрации питательных компонентов не станут лимитирующими, или пока
в культуральной жидкости концентрация продуктов метаболизма не
достигнет критического уровня, подавляющего (ингибирующего) микроорганизмы. Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста
(рис. 2.3). Она имеет S-образный характер.
Рис. 2.3. Кривая роста периодической культуры микроорганизмов
45
Различают несколько стадий роста. Сразу после посева (инокуляции) наблюдается лаг-фаза (I). В этой фазе число клеток не возрастает,
однако идут интенсивные приспособительные процессы. После окончания лаг-фазы скорость роста возрастает. Эта фаза носит название
фазы ускорения роста (II), занимает весьма небольшое время. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза (III) характеризуется постоянной
максимальной скоростью деления клеток. Логарифмическая фаза роста
сменяется фазой замедления роста (IV), когда наблюдается еще относительно интенсивный рост клеток, однако скорость роста замедляется.
Затем у многих микроорганизмов наступает стационарная фаза (V), когда концентрация биомассы не меняется во времени. Далее следует
фаза отмирания и выживания (VI), в ходе которой число жизнеспособных клеток снижается.
Количественное описание роста микроорганизмов осуществляется c помощью удельной скорости роста µ, значение которой в каждый
момент времени определяется по уравнению
,
где µ – удельная скорость роста, ч -1; х – концентрация биомассы в момент времени τ, ч.
Путем интегрирования этой зависимости определяют удельную
скорость роста за определенные промежутки времени:
,
где х1 и х2 – концентрация биомассы в начальный и конечный моменты
времени; хср – средняя концентрация биомассы в интервале времени (τ2-τ1).
Изменение в процессе ферментации метаболического коэффициента q дает возможность судить о кинетике потребления субстрата:
,
где S1 и S2 – концентрация субстрата в момент времени τ1 и τ2. В общем
случае метаболический коэффициент характеризует долю субстрата,
используемую для роста определенного количества биомассы за определенный промежуток времени. Надо отметить, что метаболический
46
2
коэффициент может быть рассчитан для любого субстрата: органического (этанол и др.), минерального (азот, фосфор) и т. д.
Рассмотренные показатели µ и q представляют собой кинетические характеристики роста культуры. Однако при целостном рассмотрении процесса важное значение имеют стехиометрические показатели – выходы по массе и энергии.
Под выходом по массе (или экономический коэффициент) понимается весовое отношение прироста абсолютно сухой биомассы (АСБ)
к количеству потребленного субстрата (г АСБ/г субстрата):
.
Однако этот показатель имеет существенный недостаток: массовый выход не характеризует эффективности процесса роста с точки зре-
ния энергии. Так, при росте микроорганизмов на глюкозе и уксусной
кислоте могут быть получены одинаковые значения Y, хотя энергия, содержащаяся в этих соединениях, различна.
Энергетический выход η характеризует долю энергии субстрата,
перешедшую в биомассу. Универсальной единицей восстановленности
является редоксон. Количество редоксонов в расчете на 1 грамм-атом
углерода определяет восстановленность вещества γ. Для субстрата с химическим составом CHpOnNq она рассчитывается по формуле
Энергетический выход обычно определяют из следующего соотношения:
где σx, σs – весовая доля углерода в биомассе и субстрате соответственно; γx, γs – степень восстановленности биомассы и субстрата. Степень восстановленности углерода в биомассе мало меняется в зависимости от вида микроорганизма и равна γx = 4,2.
Средняя весовая доля углерода в биомассе σx = 0,46.
Приведем уравнение количественной связи энергетического выхода и выхода по кислороду Y
О
2
:
47
В условиях аэробного культивирования дрожжей на этаноле в качестве целевого продукта получают микробную биомассу – продуцент
белка. В практическом отношении представляет интерес значение выхода белка из потребленного субстрата:
где Б – содержание белка, % вес.; Sо, S – начальная и конечная концен-
трация субстрата, г/л соответственно.
Эк с пе р им е нта л ьн а я ч а с т ь
1. Подготовить посевной материал. Для этого дрожжи стерильно
пересеять с музейного «косяка» (скошенной питательной среды в пробирке) на свежий «косяк» сусло-агара. Затем пересеянные «косяки» поместить в термостат при температуре 36 оС и выдержать их там в течение 24 ч. Выращенную культуру дрожжей смыть с «косяка» в стерильных условиях стерильным физиологическим раствором из расчета
5 мл физраствора на один «косяк». Полученную суспензию дрожжей
объемом 2 мл стерильно перенести в колбы со стерильной питательной
средой в объеме 100 мл.
2. Приготовить питательные среды с различными источниками углерода. Для культивирования дрожжей р. Candida в данной работе используются синтетические питательные среды, различающиеся источником углерода.
Для приготовления питательных сред готовятся растворы:
– глюкозы (раствор 20 г/л). Раствор глюкозы простерилизовать
в автоклаве 0,5 ч под давлением 0,5 атм;
– этанола (1 % об.);
– глюкозоспиртовой смеси (готовится из индивидуальных рас-
творов в соотношении 1:1).
Кроме источника углерода, для приготовления питательных сред
используются следующие источники минерального питания:
NH4H2PO4 (10 г/л), MgSO4 (0,7 г/л), Na2HPO4*12Н2О (0,7 г/л),
КН2РО4 (6,8 г/л).
Приготовленную минеральную среду объемом 250 мл простери-
лизовать в автоклаве один час под давлением 1 атм.
48
Раствор микроэлементов готовят и стерилизуют отдельно. В 100 мл
дистиллированной воды растворить 1,25 г FeSO4, 1,25 г MnSO4, 1,25 г
ZnSO4, 0,63 г NaCl и добавить 1 мл концентрированной серной кислоты.
Приготовленный раствор простерилизовать при 1 атм 10–20 мин и стерильно внести в колбу с ранее приготовленной минеральной средой из
расчета 1 мл на 1 л минеральной среды. Далее раствор стерильно разлить
по 20 мл в качалочные колбы объемом 100 мл и закрыть ватно-марлевыми
пробками.
В колбы с раствором стерильно добавить 1 % об. дрожжевого ав-
толизата в качестве фактора роста (источника витаминов, аминокислот,
ферментов и т. п.), а также приготовленные ранее растворы, содержащие источники углерода. Внимание! Этанол вносить в колбы вдали
от пламени. Затем в качалочные колбы с питательной средой внести
инокулят из расчета 1 мл приготовленной суспензии дрожжевых клеток
на 20 мл питательной среды.
3. Построить калибровочный график зависимости оптической плотности дрожжевой суспензии D от концентрации биомассы суспензии Х.
Для этого следует приготовить модельные суспензии с концентрациями биомассы, указанными в первой строке таблицы, провести
измерения их оптической плотности и заполнить вторую строку таблицы. По результатам измерений построить калибровочный график
D =f (X).
Для измерения оптической плотности использовать фотоэлектроколориметр с установкой длины волны проходящего света λ = 490 нм
для кюветы с толщиной рабочего слоя образца 5 мм.
4. Осуществить процесс культивирования дрожжей. Культивиро-
вание ведут на перемешивающем устройстве (качалке). В процессе
ферментации поддерживают следующие условия: температура 36 оС,
число оборотов качалки 200–220 мин-1. Длительность ферментации составляет 24 ч. Отбор проб в первые 6–8 ч производить через каждые
1,5–2 ч, причем первую пробу отобрать сразу после посева культуры
в питательную среду. Последняя проба отбирается по истечении 24 ч
культивирования.
В каждой пробе проанализировать оптическую плотность и, пользуясь калибровочным графиком, определить концентрацию биомассы
дрожжей. Далее определить содержание белка в биомассе, а также концентрацию этанола и глюкозы по методикам, рассмотренным далее.
Кроме, того определить количество живых и мертвых клеток в культуральной жидкости и наличие в микробных клетках гликогена.
49
Ме т од ы а н а л и т и ч е с к их и сс л е д ов а н ий
Определение оптической плотности культуральной жидкости.
Оптическая плотность служит качественным показателем содержания
биомассы в культуральной жидкости. Для определения оптической
плотности применяют фотоэлектроколориметр. При приготовлении
суспензии клеток учитывают, что наиболее точные результаты получают при работе с суспензиями, имеющими показатели на среднем
участке измерительной шкалы прибора. Для разбавления суспензий используют водопроводную воду. Измеряют светорассеяние суспензий
с помощью кюветы с длиной светового пути 0,5 см при длине волн
490 нм (зеленый светофильтр).
Подсчет числа клеток в культуральной жидкости производят
с помощью счетной камеры Горяева–Тома при микроскопировании
проб с 40-кратным объективом.
Определение концентрации этанола в культуральной жидкости.
Для качественного определения этанола в культуральной жидкости
(КЖ) проводится смешение ее проб с серной кислотой и раствором бихромата калия по следующей схеме:
1 мл Н2SО4 (конц.)
+ 0,2 мл К2Cr2О7 (2 % раствор)
+ 1 мл КЖ (отфильтрованная проба).
Цвет раствора характеризует степень присутствия этанола
в пробе: голубой цвет – содержание этанола 0,6–1 %; зеленый цвет –
содержание этанола 0,1–0,5 %; желтый цвет – отсутствие этанола.
Количественное содержание этанола определяют газохроматографическим методом с помощью газового хроматографа, снабженного
пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента используют PORAPAC-QS, в процессе определения поддерживают температуру колонок 180 оС. В качестве газа-носителя применяют инертные
газы (гелий или азот). Температура испарителя 220 оС. При расходе
газа-носителя 4,2 л/мин этанол регистрируется на 5–6-й мин после
ввода пробы. Для контроля вводят определенное количество этанола
и по соотношению высоты пиков контроля и пробы судят о концентрации этанола в среде.
Определение концентрации глюкозы в питательной среде и культуральной жидкости глюкозооксидазным методом. Ферментный пре-
парат глюкозооксидазы применяется в аналитике благодаря высокой
специфичности по отношению к α-D-глюкозе. Даже в отношении
50
своего аномера – β-D-глюкозы – способность фермента к окислению
в 150 раз ниже.
Фермент представляет собой флавопротеин. На первом этапе
ферментативная реакция протекает с образованием лактона глюконовой кислоты и восстановлением простетической группы ФАД (флавинаденидинуклеотид). Образовавшийся лактон спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты. Далее восстановленная форма ФАД передает протоны на кислород с образованием пероксида водорода в количестве, эквимолярном количеству окисленной глюкозы. Присутствующая в растворе пероксидаза катализирует окисление гексацианоферроата перекисью водорода с образованием окрашенного соединения гексацианоферриата калия. В результате реакции раствор приобретает лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству присутствующей в анализируемом растворе глюкозы. Вместо гексацианоферроата калия применяют о-дианизидин или смесь 4-аминоантипирина с фенолом. Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре.
Раствор глюкозооксидазы готовят из стандартного реактива.
В три пробирки вносят реактивы следующим образом:
– контрольная проба – 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы;
– опытная проба – 0,2 мл опытного раствора глюкозы (гидролизата
крахмалсодержащего сырья) и 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы;
– калибровочная проба – 0,2 мл калибровочного раствора глюкозы (1 ммоль/л) и 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы.
Пробирки выдерживают 15 мин при температуре 37 оС или
30 мин при 20 оС. Через 5–10 мин после начала инкубации пробирки
интенсивно встряхивают. После окончания инкубации определяют оптическую плотность при длине волны 510 нм (470–540 нм, зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против калибровочной
пробы. Окраска раствора устойчива в течение одного часа после окончания инкубации.
Содержание глюкозы в исследуемом растворе определяют по
формуле
С = (D0/ Dк) 10, ммоль/л,
где С – содержание глюкозы в опытной пробе, ммоль/л; D0 – оптическая
плотность опытной пробы; Dк – оптическая плотность калибровочной
пробы; 10 – содержание глюкозы в калибровочной пробе, ммоль/л.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]