Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Основы биотехнологии и асептики проведения процессов. Учебно-методическое пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 12 / 82 3 4 5 6 7 8 > Следующая >>>

Т е м а 1 . Б И О Т Е Х Н О Л О Г И Ч Е С К И Е П Р О Ц Е С С Ы

И А С Е П Т И К А

Теоре т и ч е с к а я ч ас т ь

Под асептикой в биотехнологии понимается комплекс мер, направленный на предотвращение попадания посторонних биологических объектов (в первую очередь микроорганизмов) в область проведения биотехнологического процесса. Причем следует отметить, что под посторонними микроорганизмами понимают любые микроорганизмы, которые не являются продуцентами. Это могут быть как патогенные, так и непатогенные организмы. Это позволяет разделить требования, предъявляемые к асептическим мероприятиям в биотехнологии и медицине. В последнем случае основной целью проведения асептических мероприятий является борьба с патогенными микроорганизмами, в то время как в биотехнологии это более широкое понятие.

В силу крупномасштабности биотехнологических процессов создание асептических условий в масштабированном оборудовании представляет проблему. Поэтому многие реализуемые в промышленности процессы проводят в частично асептических условиях. Например, культивирование дрожжей ведут в негерметичных ферментерах. Ферментационный процесс осуществляют при пониженных рН среды. Такое решение не только позволяет создать оптимальные условия для выращивания дрожжей, но и исключает возможность развиваться контаминирующим микроорганизмам, так как оптимальные значения кислотности для этих микроорганизмов лежат в областях рН, близких к нейтральному. Однако это обстоятельство не снижает уровня требований в отношении микробной чистоты посевного материала, питательных сред, подаваемого воздуха.

Особые требования предъявляются к чистоте посевного материала (инокулята). В связи с этим большинство стадий подготовки посевного материала проводят в стерильных условиях (боксированные помещения, стерильные ферментеры-маточники, стерилизация воздушных потоков и т. д.). Следует понимать, что каждый из материальных потоков в биотехнологическом процессе представляет собой потенциальный источник контаминирующих микроорганизмов. Поэтому на производстве разработан и реализуется целый комплекс мер, ориентированных на поддержание асептических требований в отношении воздушных

потоков. Поддержанию асептических условий способствует использование механических, химических, радиационных, термических мер. Эти меры направлены на поддержание асептических условий на разных стадиях производства, начиная с подготовки посевного материала, питательной среды и кончая самим процессом ферментации и получения целевого продукта, в качестве которого может выступать как сама биомасса, так и продукты вторичного биосинтеза. Особые требования к асептике предъявляют производства тонкого микробиологического синтеза.

Для достижения асептических условий в биотехнологии активно используют методы механической защиты. К ним можно отнести герметизацию оборудования, удаление механических примесей из питательных сред и/или воздуха, изоляцию узлов и соединений. В биотехнологии также активно используют физические методы защиты, такие как кипячение, стерилизация, обработка питательных сред ультразвуком и т. д. В качестве примеров используемых химических методов можно привести обработку поверхностей в помещении и аппаратуры химическими антисептиками.

Наиболее широко в промышленности в настоящее время применяют термические методы асептики. Они отличаются интенсивностью и временем температурного воздействия. Так, при пастеризации происходит нагревание до температуры 70–72 oС в течение 15–20 мин. В этом случае происходит гибель вегетативных форм микроорганизмов. Споровые формы остаются жизнеспособными. Поэтому пастеризованные среды и субстанции не могут храниться в течение длительного времени. Причем рекомендуется хранение осуществлять при пониженных температурах (4–8 oС). Пастеризации подвергаются молоко, соки и другие продукты, чей состав может существенным образом измениться при более жесткой термической обработке. Стерилизация подразумевает нагрев объекта выше 100 oС. В этом случае погибают как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов. Достижение температур выше температуры кипения происходит путем использования специального оборудования (автоклавов) либо перегретого пара. Выбор аппаратурного оформления стадии стерилизации во многом определяется объектом. Так, перегретый пар применяют при стерилизации различного оборудования и питательных сред в крупномасштабном производстве. А питательные среды и оборудование в лабораторной и медицинской практике, а также при подготовке посевного материала стериализуют в автоклавах.

В последние годы в практике биотехнологических производств для поддержания асептических условий стали применять различные формы лучистой энергии, например ультрафиолетовые (УФ) лучи, ионизирующее излучение. Результаты использования этого вида воздействия могут отличаться в зависимости от длины волны и дозы облучения. Так, известно, что при действии ультрафиолетовых лучей происходит нарушение функций мембран, угнетаются окислительные процессы в клетках, нарушаются процессы транскрипции, трансляции, происходят мутации. Описанные процессы способствуют эффективному обеспложиванию контаминирующей микрофлоры. Однако УФ-лучи активно поглощаются водой, поэтому область применения этого воздействия сокращается до обработки поверхностей, воздуха, а также обеззараживания воды, для чего в настоящее время разработаны специальные системы, работающие в тонком слое. Они позволяют уничтожать до 99 % микрофлоры.

Химические антисептики могут оказывать как бактерицидное и фунгицидное, так и бактериостатическое и фунгистатическое действие. В первом случае происходит гибель микроорганизмов (бактерий или микроско- пических грибов), в то время как во втором случае имеем только подавление их роста, но при этом организмы остаются живыми. Полученный эффект применения химических антисептиков определяется целым рядом факторов, в том числе чувствительностью организма, длительностью действия, дозой, природой антисептика и т. п.

Известно, что механизм действия антисептиков различен. В ряде случаев происходит нарушение целостности клеточных оболочек (в первую очередь цитоплазматической мембраны). Таким образом действуют сильные окислители, такие как хлор, йод, перекись водорода, перманганат калия. Эти антисептики также оказывают негативное влияние на метаболизм клетки в результате взаимодействия с основными ее компонентами. Практически таким же образом действуют на клетку альдегиды, спирты, анилиновые красители. Органические кислоты (салициловая, сорбиновая) изменяют уровень кислотности цитоплазмы, что вызывает снижение активности ферментов. При использовании химических антисептиков следует помнить, что они не должны попадать в продукты питания, а также на поверхности, предполагающие непосредственный длительный контакт с человеческим организмом. Поэтому их обычно используют для дезинфекции тары, инвентаря. Они также могут быть использованы для увеличения сроков хранения пищевой продукции (например, сорбиновая кислота), однако при этом недопустимо превышение разрешенных доз их использования.

В настоящее время в биотехнологической промышленности в приоритете в основном термический метод стерилизации. Выбор варианта конкретной реализации этого метода во многом детерминируется характеристиками оборудования или среды, используемыми в биотехнологическом процессе, а также их объемами. Так, например, термическая обработка может быть проведена несколькими способами: острым паром, глухим паром, прогреванием ферментера паром, который генерируется в самом сосуде, автоклавированием. Последний метод предпочтителен при обработке небольших объемов питательной среды, ферментеров малых объемов, а также мелкого оборудования. В этом случае используют автоклавы, которые позволяют получить давление пара выше атмосферного. Для более крупных объемов применяют обработку паром, который может генерироваться как в самом аппарате, так и вне его. Для генерации пара в аппарате применяют ТЭН, который вводят в стерилизуемый объект. Однако этот метод может быть использован только при условии, если среды не образуют нагара на нагревателе. В противном случае нагревание производят перегретым паром, который повышает температуру либо через перегородку (глухой пар), либо путем непосредственной подачи в аппарат через инжектор или барботер (острый пар). Наиболее часто в биотехнологической промышленности для стерилизации оборудования и питательных сред используют острый пар.

Вместе с тем в промышленности нашли применение также методы химической дезинфекции. В основном такие методы используют для обработки различных поверхностей такими высокоэффективными препаратами, как 3 % раствор хлорамина, препараты на основе 5 % растворов четвертичных аммонийных солей, щелочные растворы. Для стерилизации питательных сред в лабораторной практике часто используют соединения, которые могут самопроизвольно разлагаться. Но при этом не происходит накопления в питательной среде токсичных компонентов. К таким агентам можно отнести β-пропиолактон, окись этилена, окись пропилена. Однако, несмотря на гарантии производителей относительно нетоксичности этих соединений и продуктов их разложения, наблюдались случаи ингибирования роста микроорганизмов после подобной стерилизации.

Более «чистыми» в экологическом отношении являются методы, использующие физические принципы дезинфекции. Фильтрационный метод подразумевает пропускание питательных сред или газов через мелкопористые фильтры. Причем диаметр пор фильтра должен обеспечивать задержание микробных клеток. Таким образом в биотехнологии в основном дезинфицируют воздух, подаваемый в ферментер. Также этот метод может быть применим для жидкостей. Основное требование, которое

предъявляется к стерилизуемым жидкостям, состоит в отсутствии большого количества взвешенных частиц, поскольку они способствуют забиванию пор, в результате чего фильтр быстро выходит из строя.

В литературе имеются данные о возможности применения радиационных методов стерилизации в биотехнологии. Речь идет об излучении ультрафиолетового и рентгеновского диапазонов. Однако в связи с рядом проблем, возникающих при использовании этих методов (повышенные требования к технике безопасности, необходимость специфического оборудования, низкая производительность), они не получили широкого распространения.

Основные методы стерилизации, используемые в биотехнологии, представлены в табл. 1.1.

Таблица 1.1

Методы стерилизации оборудования, питательных сред и воздуха

Метод

Краткая характеристика

Область применения

1 2 3

Термообработка:

Нагревание объекта стерилизации в течение времени, достаточного для гибели всей микробной популяции

Основной метод стерилизации биореакторов, питательных сред и добавок, вспомогательного оборудования и фильтров для стерилизации воздуха

– острым паром

Подача струи пара под высоким давлением в аппарат с питательной средой с помощью барботера или парового инжектора

Стерилизация аппаратов и сред

– глухим паром

Пар изолирован от стерилизуемых сред металлическими стенками (например, пар пропускают по змеевику)

Стерилизация некоторых питательных сред или их компонентов (например, масел)

– паром, генерируемым в самом сосуде, подлежащем стерилизации

Используют электронагреватели, вводимые в стерилизуемый объект

Стерилизация биореакторов и сред, если последние не пригорают к нагревателю

– в автоклаве

Стерилизуемые материалы вносят в автоклав – аппарат, где вода доводится до кипения при повышенном давлении

Стерилизация некоторых лабораторных биореакторов, небольших объемов жидкости, мелких элементов вспомогательного оборудования

Окончание табл. 1.1

1 2 3

Дезинфекция (химическое воздействие)

Применяют химические дезинфицирующие агенты (β-пропиолактон, окись этилена, окись пропилена), самопроизвольно разлагающиеся в воде без образования токсических продуктов

Стерилизация питательных сред, в основном для лабораторных биореакторов

Излучение

Обработка ультрафиолетовым и радиоактивным излучением

Не получил распространения

Ультразвуковое воздействие

Обработка ультразвуком жидких сред с определенным подбором частот (22–44 кГц)

Экспериментальный метод, рекомендован для широкого промышленного применения

Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 1

К И Н Е Т И К А Г И Б Е Л И М И К Р О О Р Г А Н И З М О В

Цель работы: определение основных показателей, характеризующих кинетику гибели микроорганизмов в питательных средах.

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

– суспензия дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

– микроскопы;

– камера Горяева–Тома;

– водяная баня (термостат);

– краситель (метиленовый синий);

– пробирки;

– пипетки объемом 1 или 2 мл;

– фильтровальная бумага;

– марлевые салфетки

Кр а тк и е т е о р е т и ч е с ки е св е де н ия

В биотехнологических процессах одновременно протекают два противоположно направленных процесса – рост и отмирание микробных клеток. В процессе ферментации при анализе концентрации биомассы имеют дело с обобщающим показателем, который учитывает оба этих процесса. Однако ряд стадий биотехнологического процесса направлены только на уничтожение микробных клеток и/или спор микроорганизмов полностью или частично. К таким стадиям относятся стерилизация жидких и плотных питательных сред, оборудования. В связи с этим становится понятным важность определения параметров режимов, обеспечивающих необходимую степень асептики.

В биотехнологической промышленности в настоящее время основным методом стерилизации является термический, который подразумевает прогревание при повышенной температуре в течение определенного промежутка времени.

Известно, что скорость гибели микроорганизмов пропорциональна количеству клеток (или спор):



󰇠



 󰇟󰇠

󰇟



где [хо] – число жизнеспособных особей микроорганизмов в начальный момент обработки при времени τ = 0; [хо] – число жизнеспособных особей микроорганизмов после определенного времени обработки τ.

После интегрирования этого уравнения можно получить следующую зависимость:



󰇟󰇠

󰇟󰇠

 

 

 



󰇟󰇠

󰇟󰇠



где k – удельная скорость гибели, мин-1;



󰇟󰇠

󰇟󰇠

– критерий стерилиза-

ции. Критерий стерилизации характеризует достигнутую степень асептики процесса или среды.

На практике важной характеристикой оказывается время, за которое концентрация выживших клеток уменьшается в 10 раз. Учитывая само определение критерия стерилизации, можно определить значение этого показателя, который соответствует 2,303.

Для практического использования часто пользуются таким показателем, как время, в течение которого количество жизнеспособных клеток уменьшается в десять раз: τ

= 2,303/k. В зависимости от харак-

теристик, предъявляемых к стерилизуемому объекту, задают различные значения этого показателя. Тогда, зная значение этого показателя и значение удельной скорости гибели при определенной температуре, можно определить время, необходимое для проведения стерилизации.

Зависимость удельной скорости гибели клеток от температуры описывается уравнением Аррениуса:

k = 

-E/RT

где А – предъэкспоненциальный множитель. Постоянную E в этом уравнении по аналогии с химической кинетикой называют энергией активации процесса гибели микроорганизмов,

Следует отметить, что первоначально это уравнение было выведено для описания влияния температуры на скорость химической реакции. Однако в клетке одновременно протекают несколько тысяч химических реакций. Применение уравнения Аррениуса для описания кинетики гибели живых клеток основано на использовании принципа «узкого места», который предполагает наличие одной или ограниченного количества метаболических реакций, скорость которых определяет скорость остальных реакций, а следовательно, и всего метаболизма в целом.

Эк с пе р им е нта л ьн а я ч а с т ь

1. Предварительно перемешанную дрожжевую суспензию разлить по 3 мл в 4 пробирки. Пробирки пронумеровать. Содержимое пробирки № 1 использовать в качестве нулевой пробы (не подвергать нагреванию) для подсчета дрожжевых клеток в суспензии. Подсчет общего числа клеток в отобранных пробах осуществить с использованием счетной камеры Горяева–Тома. Кроме того, определить число живых клеток, для чего в пробирку добавить 1–2 капли разбавленного раствора тиазинового красителя метиленовый синий.

2. Остальные три пробирки поместить в водяную термостатируемую баню с заданной температурой эксперимента (Т = 65, 85 и 100 оС).

3. Через каждые 15 мин отбирать одну из пробирок и определять общее количество клеток и количество живых клеток.

4. Эксперименты по описанной методике также провести для температур 85 и 100 oС

Подсчет клеток в счетных камерах – этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов: дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева–Тома (рис. 1.1), хотя можно и другие. Эта камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.

Рис. 1.1. Камера Горяева–Тома: а – вид сверху; б – вид сбоку;

в – вид сетки камеры при малом увеличении микроскопа

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов, 100 – на прямоугольники и 100 остаются чистыми. Каждая их 15 вертикальных и горизонтальных полос сетки Горяева имеет ширину, равную 1/5 мм, причем каждая третья полоса разделена, в свою очередь, на 4 узкие полоски шириной 1/20 мм, при пересечении которых образуются маленькие квадратики площадью 1/400 мм2. Они составляют 25 групп из 16 квадратиков. Для подсчета используются большие квадраты, разделенные на 16 маленьких.

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3–5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в водной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5 % водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8× или 40×. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3–4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой суспензией микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле

<<< < Предыдущая 12 / 82 3 4 5 6 7 8 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]