Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Диагностика туберкулеза животных
.pdf
Для определения ниацина в литературе описаны различные модификации теста К. Коnnо (Medveczky, 1960;
I. Lohaj, 1963; Поленска и др., 1962; И.Э. Тюри, М.Э. Тюри,
1964; Бараускене, 1972, 1974).
Учитывая способность различных видов микобактерий выделять нитраредуктазу, S. Virtanen (1960) предложил
реакцию восстановления нитратов, которая позволяет дифференцировать микобактерии человеческого вида (они выделяют нитраредуктазу) от микобактерий бычьего, птичьего
видов и некоторых атипичных микобактерий, неспособных
выделять нитраредуктазу.
В диагностических лабораториях как медицинского,
так и ветеринарного профиля для идентификации микобактерий широко используют амидазную пробу R. Bonicke
(1959), включающую в себя сокращенный амидный ряд:
ацетамид, мочевину, никотинамид, пиразинамид, сукцинамид и аллантоин. Сущность метода заключается в том, что
различные виды микобактерий, используя определенные
амиды, расщепляют их с выделением аммиака, который
можно улавливать методом Русселя, реактивом Несслера и
др. Имеются два метода определения амидазной активности
микобактерий: количественный биохимический метод и качественный биохимический метод (Bonicke, Lisboa, 1959).
М.Н. Зыков, Т.Б. Ильина (1978) считают полезным включать
в малый амидный ряд также формамид, который ферментирует быстрорастущие микобактерии (М. fortuitum, М. smegmatis и М. phlei). Формамидазную активность определяют
по методу М.М. Дыхно и др. (1964). Следует указать, что
одни исследователи (Должанский, 1964; Василев, I971;
Юдин, 1972, 1976) считают, что формамидаза содержится
только у кислотоустойчивых сапрофитов, другие (Дыхно
и др. 1964; Зыков, Ильина, 1978) полагают, что формамидазной активностью обладают и некоторые представители
атипичных микобактерий. С точки зрения наших данных
(Колычев, 1990), не все кислотоустойчивые сапрофиты содержат формамидазу. Этот вопрос нуждается в дополнительном изучении.
61
Список и характеристику биохимических методов
идентификации кислотоустойчивых микобактерий можно
было бы продолжить, однако рамки монографии не позволяют нам этого сделать. Поэтому мы лишь перечислим те
из них, которые наиболее часто используются в лабораторной практике. К таковым иным можно отнести определение
каталазной и арилсульфатазнoй активности, рост на среде
с салицилатом натрия, деградацию (разрушение) натрия салицилата, ПАСК, использование нитрата кик единственного источника азота, устойчивость к 5%-м хлориду натрия, к
пикриновой кислоте, сахаролитическую активность, гидролиз твина-80 и др. Указанные тесты апробированы многочисленными авторами (Wayne, 1962; Макаревич, Афанасьева, 1968; Ильина, Оречкина, 1972; Pavlas, 1973; Сидоркина, 1973; Бараускене, 1973; Михайлова, 1973; Дыхно и др.,
1975; Wayne et. al., 1976; Зыков, 1976; Ильина, Молдавер,
1979; Керимжанова, 1980).
Подводя итог вышеизложенному, можно сказать, что
лабораторная диагностика туберкулеза, основанная на микроскопии, выделении чистой культуры, идентификации ее
по культурально-биохимическим и патогенным свойствам,
сделала значительный шаг вперед, однако все еще считается
трудоемкой и не всегда эффективной. Поэтому исследователи продолжают работу по поиску новых, более перспективных методов обнаружения и идентификации кислотоустойчивых микобактерий.
В последние годы с целью диагностики туберкулеза
животных и человека, а также идентификации кислотоустойчивых микобактерий широко апробируются серологические
методы, основанные на иммунологических реакциях.
W. Schafer (1967) показал, что М. avium, М. kanzasii и
М. chelonei могут быть идентифицированы в реакции аг-
глютинации с помощью специфических антисывороток,
полученных обычным способом. Методику Шефера с положительными результатами испытывали Н. Saito (1968),
А.М. Кадочкин (1979), Т.Н. Козулицина и др. (1980).
62
В дальнейшем упростили методику Шефера и предложили использовать метод агглютинации на предметных стеклах. Эта реакция с успехом была использована Э.А. Шарифуллиным (1981) в качестве экспресс-метода для дифференциации микобактерий третьей группы по Е.Н. Runyon.
Достаточно широкую известность получил метод
флюоресцирующих антител (МФА), который используется для обнаружения антител в сыворотке крови животных,
больных туберкулезом, и идентификации микобактерий в
препаратах их чистых культур (Кноринг, 1970; Кузьмин и
др., 1971; Нелюбин, 1972).
Авторы считают, что метод флюоресцирующих антител может быть использован для идентификации микобактерий в культурах и их антигенов в исследуемых тканях. Однако применение флюоресцирующих антител для изучения
микобактерий на данном этапе развития науки еще не получило широкого применения, главным образом из-за того, что
очень трудно получать высокоиммунные сыворотки. Кроме
того, в опытах выявлена серологическая общность между
истинными микобактериями туберкулеза и атипичными, а
также сапрофитными микобактериями, что накладывает отпечаток на получение стабильных результатов.
Наиболее широкое применение для идентификации
микобактерий получили методы диффузионной преципитации в агаре. Об этом свидетельствуют работы В.М. Должанского (1964), Б.Н. Козьмина-Соколова (1966), R. Rees (1971),
М.П. Зыкова, Т.Б. Ильиной (1978) и др.
Существуют и другие методы для определения вида
микобактерий: фаготипирование (Кособуцкий, 1971; Зыков,
1976; Redmond et al., 1979); иммуноэлектрофорез (Mitze,
1978); микроколориметрия, радиометрия, кожные реакции
с сенситинами (Magnusson, 1969; Зыков, Ильина, 1978 и
др.); газовая хроматография (Пинчук, Лазовская, 1981; Рачкова и др., 1991; Воробьев, Куликовский, 1991; Бибергалов,
1991); лазерная спектроскопия (Околелов и др., 1991) и др.
Итак, заключая весьма краткий, но вполне достаточ-
63
ный для понимания вопроса обзор литературы по классификации и методам идентификации микобактерий, следует
указать, что ни одна из известных классификаций микобактерий, равно как и ни один из предложенных методов их
идентификации, не дают стопроцентного ответа о виде микобактерий. К сожалению, далеко не все тесты могут быть
использованы в практических лабораториях. Даже в специализированных лабораториях результаты коллективного
изучения закодированных культур были неоднозначными.
Следовательно, необходима дальнейшая апробация, совершенствование и обработка наиболее простых и легковыполнимых тестов в бактериологических лабораториях или
практических учреждениях.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Были изучены морфологические, тинкториальные,
культуральные, биохимические и патогенные свойства культур микобактерий, изолированных из организма животных
и объектов внешней среды животниводческих ферм, благополучных и неблагополучных по туберкулезу.
2.1. Материалы и методы исследования
Объектами исследования были 1133 пробы диагностического материала, в том числе 244 пробы (кусочки внутренних органов и лимфатических узлов) от крупного рогатого
скота, реагирующего на туберкулин для млекопитающих,
769 проб от лабораторных животных и телят, экспериментально зараженных возбудителем туберкулеза бычьего вида
и атипичными микобактериями, а также 120 проб молока и
проб-смывов с молочного оборудования.
Лабораторные исследования проводили согласно «Методическим указаниям по диагностике туберкулеза животных» (1976), «Наставлению по диагностике туберкулеза
животных» (1986) и ГОСТ 26072-84 «Животные и птица
сельскохозяйственные» (1984).
64
Дифференциацию и идентификацию микобактериальных культур проводили в соответствии с методическими
рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая
идентификация микобактерий» (Ильина, 1975, 1980). У выделенных культур изучали:
– скорость роста субкультур на среде ЛевенштейнаЙенсена при температуре 22, 37, 45 и 52°С;
– характер роста на среде Левенштейна-Йенсена и мясопептонном бульоне при 37°С;
– характер микророста микобактерий по методу Прайса (1941) с использованием среды Сотона;
– характер колоний: величину, форму, поверхность,
консистенцию и т.д.;
– тинкториальные свойства (окраска по Цилю-Нильсену, Граму, Мурохаши);
– способность к пигментообразованию на свету и в
темноте по методу Kubica (1973);
– рост на среде Левенштейна-Йенсена с содержанием в 1 мл среды 0,5 и 1,0 мг салицилата натрия по методу
Tsuкamura (1962);
– рост на среде Левенштейна-Йенсена с содержанием
в 1 мл среды 2,0 мг парааминосалицилата натрия по методу
Tsukamura (1962);
– толерантность к 5%-му хлориду натрия по методу
Kestle et al. (1967);
– реакцию гидролиза твина-80 по методу Wayne (1962);
– ниациновый тест по методу Коnnо (1957) в модификации Э.В. Сидоркиной, А.С. Бейсенбекова (1981);
– редукцию нитратов по методу Tsuкamura et al. (1966);
– амидазную активность по методу Taguet et al. (1967)
в модификации Т.Б. Ильиной (1978);
– формамидазную активность по методу Nagayama et
al. (1961) в модификации М.М. Дыхно (1964);
– арилсульфатазную активность по методу Tarshis
(1964), Wayne et al. (1967);
– каталазную активность по методу Wayne (1962);
65
– деградацию салицилата и парааминосалицилата натрия по методу Tsuкamura (1966);
– лекарственную чувствительность к препаратам I
ряда: стрептомицину, изониазиду, ПАСК определяли непрямым методом, выращивая культуры микобактерий на среде
Левенштейна-Йенсена (без крахмала), содержащей различные концентрации препаратов.
Для отличия микобактерий туберкулеза от кислотоустойчивых сапрофитов при бактериоскопическом исследовании применили методику Л.Е. Скрябиной (1955).
Для определения видовой принадлежности микобактерий туберкулеза и степени их патогенности заражали лабораторных животных по общепринятым методикам. Павших
и убитых по истечении 3 мес после заражения животных
вскрывали, учитывали наличие и характер туберкулезных
изменений во внутренних органах и лимфатических узлах
по методике А.И. Тогуновой. Посев патологического материала проводили на среды Левенштейна-Йенсена по методу
Гона-Левенштейна-Сумиоши.
При изучении культурально-морфологических, тинкториальных, биохимических свойств и лекарственной
чувствительности у эпизоотических культур микобактерий,
а также культур, полученных в экспериментах, в качестве
контроля использовали референтные культуры микобактерий, любезно предоставленные нам Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Тарасевича, Центральным научно-исследовательским институтом
туберкулеза и Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии (М. bovis шт. 8., М. avium
шт. «Берлин», М. avium шт. 19, М. intracellularae, М. xeno-
pi, М. gordonae, М. gastri, М. terrae, М. nonchromogenicum,
М. fortuitum, М. diernhoferi, М. В-5, М. smegmatis, М. phlei,
М. avescens, М. vaccae).
Сравнительное изучение разных методов введения суспензий исследуемых культур лабораторным животным для
66
дифференциации микобактерий проводили на 99 морских
свинках, 27 кроликах и 30 куриных эмбрионах, используя
методики, предложенные Honi (1925), Kite и Patnode (1952),
Todao-Todda, Fodor-Ferenczi. Объектом исследования слу-
жили 27 штаммов музейных и производственных культур
микобактерий.
В первом опыте при сравнительном изучении интратестикулярного и подкожного методов заражения использовали 36 морских свинок массой тела 300-350 г, которых
разделили на 12 групп по 3 в каждой. Заражение проводили
культурой М. bovis (шт. 8, 14, 92, 94).
Животных 1, 2, 3 и 4-й групп заразили подкожно во
внутреннюю поверхность бедра в дозе 1 мг бактериальной
массы в 1 мл физиологического раствора. Морских свинок
5, 6, 7 и 8-й групп заразили интратестикулярно в дозе 1 мг
бактериальной массы в 0,4 мл физиологического раствора.
Животные 11-й и 12-й групп были контрольными (интактными). Во всех опытах степень патогенности изучаемых
культур оценивали по срокам гибели зараженных животных, по снижению массы тела и по интенсивности поражения внутренних органов. В первом опыте макроскопические
изменения внутренних органов и лимфатических узлов оценивали по схеме А.И. Тогуновой, согласно которой максимальная пораженность равна 30-31. При индексе пораженности меньше 15 туберкулезный процесс рассматривали
как маловыраженный, а культуру – как слабовирулентную;
индекс пораженности, равный 15-18, соответствовал туберкулезу средней тяжести и средней вирулентности культуры,
а индекс 24-31 – тяжелому развитию туберкулеза и высокой
вирулентности культуры. Использование числовых показателей (индексов) при оценке патолого-анатомических изменений позволило применить математический метод для
проверки достоверности результатов опытов.
Во втором опыте, поставленном для выявления патогенности атитипичных микобактерий, 45 морских свинок
разделили на 9 групп по 5 в каждой. Животным 1, 2, 3 и 4-й
67
групп микобактериальные суспензии (М. avium, М. smegma-
tis, М. fortuitum, М. phlei) вводили под кожу в дозе 1 мг бак-
териальной массы в 1 мл физиологичсского раствора; животным 5, 6, 7, 8-й групп вводили те же культуры и в той же
последовательности в тестикулы в дозе 1 мг бактериальной
массы в 0,4 мл физиологического раствора; животные 9-й
группы были контрольными (интактными).
В этом опыте для оценки характера патолого-анатомических изменений у свинок использовали другой цифровой показатель – селезеночный индекс (СИ), так как индекс пораженности по Тогуновой применяют при наличии
выраженных макроскопических изменений туберкулезного
характера, которые, как правило, не развиваются у лабораторных животных, инфицированных атипичными микобактериями.
Объектами исследования служили культуры микобактерий, выделенные нами от крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин, и дифференцированные как
М. avium, М. smegmatis, М. fortuitum и М. phlei. Исследуемые
культуры по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам имели идентичные показатели с референтными штаммами этих же видов.
Клинические наблюдения за морскими свинками вели
в течение 3 мес. При патолого-анатомическом вскрытии животных через 30 и 90 дней отбирали материал для бактериологического и гистологического исследований.
Для выяснения достоверности внутрикожного метода
заражении при дифференциации микобактерий туберкулеза
от атипичных мы провели три эксперимента на 18 морских
свинках и 27 кроликах массой не менее 3000 г. В опытах
на аналогичных по возрасту и массе тела здоровых животных было изучено 27 культур микобактерий, из них музейных: М. bovis шт. 8, М. avium шт. «Берлин», 19, М. gordonae,
М. fortuitum, М. vaccae, М. phlei, М. smegmatis, М. diernhoferi;
производственных: М. bovis шт. 14, 92, 94, 99, 100, М. avium
шт. 163, М. gastri шт. 63, М. terrae шт. 66, М. gordonae шт.
68
125, M. fortuitum шт. 19, 70, 127, М. smegmatis шт. 129, 130,
М. phlei шт. 126, М. avescens шт. 2, 81, М. diernhoferi шт. 64.
Культуру каждого из перечисленных штаммов вводили
трем морским свинкам и трем кроликам в дозе 0,1 мг полувлажной бактериальной массы, суспендированной в 0,1 мл
физиологического раствора. Морским свинкам суспензии
вводили в четыре изолированные точки живота, 18 кроликам – в область наружного края уха, так чтобы площадь для
одной пробы была не менее 2 см, а 9 кроликам суспензии
микобактерий инъецировали в кожу после ее депиляции на
внутренней стороне локтевого и коленного суставов в той
же дозе. Реакцию в месте введения культуры учитывали через 48, 72 ч и в последующем через каждые трое суток до
гибели животных. При этом определяли средние размеры
(диаметр) воспалительной реакции по группе, время появления некрозов и язв, наличие вторичных воспалительных
изменений, начало и окончание заживления с эпителизацией кожного дефекта.
В четвертом опыте в качестве экспериментальной модели для дифференциации атипичных микобактерий от возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота использовали
6-9-дневную хорион-аллантоисную оболочку развивающегося куриного эмбриона, при этом провели сравнительное
изучение макроскопических и гистологических изменений
хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов при заражении различными культурами микобактерий: М. bovis
шт. 14, М. avium шт. «Берлин», М. phlei, М. gordonae, М. for-
tuitum, М. smegmatis. Каждой культурой заражали по пять
эмбрионов. Заражение проводили суспензией, приготовленной из расчета 0,1 мг культуры в 0,2 мл физиологического
раствора, которую наносили шприцем на поверхность через
отверстие в скорлупе в области воздушного мешка. В качестве контроля пяти эмбрионам на поверхность ХАО наносили 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Все
эмбрионы выдерживали в термостате в течение 8-10 сут при
38°С. После инкубации их вскрывали и изучали состояние
69
ХАО. Участок оболочки вырезали и фиксировали в 10%-м
нейтральном формалине, далее фиксированную оболочку
заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали
гематоксилин-эозином. Одновременно при взятии материала для гистологического исследования отбирали материал
для бактериологического исследования.
Следующим этапом работы было изучение достоверности шести культурально-биохимических тестов, рекомендованных M. Tsukamura et al. (1962, 1966), D. Kestle et al.
(1967) и А.А. Прозоровым (1956) для дифференциации микобактерий:
1) определение чувствительности микобактерий к 0,05
и 0,1%-му салицилату натрия;
2) определение чувствительности к 0,2%-му ПАСК;
3) определение устойчивости микобактерий к 5%-му
хлориду натрия;
4) тест деградации салицилата натрия;
5) тест деградации ПАСК;
6) определение чувствительности микобактерий к кислотно-основным индикаторам (малахитовая зелень и нейтральрот), добавляемым в питательные среды Петраньяни и
Левенштейна-Йенсена. При изучении указанных тестов использовали 69 штаммов референтных и производственных
культур микобактерий, суспензии которых высевали в 4968
пробирок со средами.
Приготовление сред с добавлением различных препаратов и методики проведения опыта изложены Т.Б. Ильиной в методическиx рекомендациях «Бактериологическая
и биохимическая идентификация микобактерий» (1980) и
А.А. Прозоровым (1956).
Приготовление взвесей микобактерий в экспериментах
по изучению выживаемости и влиянию физических факторов на возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота и
атипичные микобактерии, находящиеся в воде, физиологическом растворе и молоке, осуществляли из расчета 1,5 млн
микробных тел в 1 мл исследуемого материала.
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]